聚木糖酶處理桉木預水解液制備低聚木糖的研究

陳嘉川 董吉冉 楊桂花徐 豐 吉興香

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室/制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室，山東濟南，250353）

低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）又稱木寡糖，是一種由木糖分子通過β-1,4糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，其主要成分為木二糖、木三糖和木四糖的混合物[1]。低聚木糖具有較好的理化性質，例如選擇性增殖腸道益生菌[2]；降低膽固醇、提高鈣的生物利用度[3]；抗氧化、抗菌、增強免疫力、改善心血管系統(tǒng)[4]；可滿足糖尿病人及肥胖癥人對甜度的需求[5-6]等。因此，低聚木糖被認為是目前最有前景的功能性低聚糖之一，廣泛應用于食品及醫(yī)藥行業(yè)[7]。

目前國內外生產低聚木糖的方法主要有自水解、酸水解、微波降解法和酶水解[6]。自水解方法操作簡單、無污染，但是對設備要求較高，精制過程繁瑣，且產物得率和純度較低。酸水解方法過程簡單，反應迅速，但是對設備要求高、反應過程不易控制、產物得率低、有毒副產物含量高[8]。微波降解法加熱方式簡單方便，具有加熱速率快、可選擇性加熱、對熱能消耗量少及反應副產物少、所得產物純度高等優(yōu)點，但多局限于實驗室研究階段[9]。酶水解主要是利用內切聚木糖酶選擇性切割木糖單元間的糖苷鍵。該方法條件溫和、對設備無特殊要求、易于控制，且制備過程不產生有毒副產物，制備所得低聚木糖產品純度較高，是一種清潔環(huán)保型低聚木糖制備工藝[10]。

據報道，目前市場上的低聚木糖大多是由玉米芯、麥麩等農林廢棄物生產而來[6,11]。由于這些原料所含雜質較多，因此精制工藝較為繁瑣，生產成本高，使低聚木糖產品價格較高，限制了其在普通食品中的擴大應用[7]。近年來，隨著溶解漿市場需求量的不斷提高，預水解液作為溶解漿生產過程中的副產物其產量日益增加[12-13]。預水解液中含有大量的半纖維素，部分企業(yè)將預水解液與黑液混合燃燒產生熱量，降低了資源利用率[14-15]。闊葉木預水解液中的半纖維素糖類主要是低聚木糖和聚木糖，因此是生產低聚木糖的良好資源[16-17]。利用預水解液生產低聚木糖不僅可以為企業(yè)帶來額外的利潤收入，同時可以豐富低聚木糖的生產途徑，符合生物質精煉的要求。

本研究以桉木預水解液為原料，首先采用Ca(OH)2、活性炭對預水解液進行純化，制備得到二級處理預水解液，然后通過聚木糖酶處理制備富含木二糖～木四糖的三級處理預水解液，探討聚木糖酶處理過程中不同因素對三級處理預水解液中低聚木糖含量的影響，并對所制備的低聚木糖產品進行分析與表征，為預水解液中半纖維素的高值化利用提供理論指導。

1 實 驗

1.1 材料及試劑

桉木預水解液，山東太陽紙業(yè)有限公司提供。

Ca(OH)2，分析純，天津恒興試劑有限公司；活性炭，磷酸活化、木質、過200目，廣東海燕活性炭有限公司；聚木糖酶，酶活70000 U，山東隆科特酶制劑公司；KBr，光譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；液體NaOH，色譜純、純度50%，美國Thermo-Fisher公司；木糖、木二糖、木三糖及木四糖，標準品，上海意果科技有限公司；透析袋：MD34、200 Da，美國邁姆生物科技有限公司；商品低聚木糖，食品級，XOS-95，購于山東龍力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桉木二級處理預水解液的制備

向桉木預水解液中加入用量1%（以預水解液質量計）的Ca(OH)2，以150 r/min的轉速攪拌處理30 min，后置于離心機中以4500 r/min的轉速離心3 min，取上清液，稱為一級處理預水解液；向一級處理預水解液中加入用量0.8%（以一級處理液質量計）的活性炭，吸附10 min后離心（4500 r/min）3 min，取上層清液，稱為二級處理預水解液。各級處理預水解液中木素、木糖、乙酸和糠醛的含量如表1所示。從表1可知，經過Ca(OH)2和活性炭處理后，預水解液中木素脫除率較高為80.3%，糠醛完全脫除，總木糖損失率較低為9.6%。另外，Ca(OH)2處理使聚木糖側鏈上連接的乙?；撀湎聛硇纬梢宜幔瑥亩岣吡怂庖褐械囊宜岷?。二級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4的含量如表2所示。

表1 各級預水解液化學成分分析 g/L

表2 二級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量 g/L

1.2.2 聚木糖酶處理制備三級處理預水解液

向50 mL錐形瓶中各加入20 g二級處理預水解液，分別加入用量為2、5、10、20 U/g的聚木糖酶，將錐形瓶置于恒溫搖床中，以150 r/min的轉速搖晃處理，探究處理時間（0.67、1、2、3、6、18 h）、處理溫度（45、55、60℃）和pH值（4.5、5.5、6.5）對三級處理預水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響。反應完成后，將三級處理預水解液置于沸水浴中處理10 min使聚木糖酶滅活，后置于離心機中以4500 r/min的轉速離心3 min，收集上清液用于木糖及低聚木糖DP2～4含量的檢測。

1.2.3 低聚木糖的純化

將聚木糖酶處理后的三級處理預水解液置入透析袋中透析處理48 h，以除去其中剩余的小分子木素等雜質。透析完成后，將透析液進行旋轉蒸發(fā)除去部分水分，然后將濃縮糖液進行冷凍干燥得到低聚木糖產品，用于后續(xù)分析與表征。

1.3 檢測與分析

1.3.1 預水解液中木糖、低聚木糖及總木糖含量的檢測

取1 mL預水解液稀釋適宜倍數(shù)，采用離子色譜儀（ICS-5000型，美國Thermofisher公司），以Dionex CarboPacTM PA200（3 mm×250 mm）為分析柱，以CarboPacTM PA200（3 mm×50 mm）為保護柱，柱溫30℃，取樣25 μL，采用100 mmol/L NaOH與500 mmol/L NaOAc溶液，以0.3 mL/min的流速梯度淋洗，測定預水解液中木糖、木二糖、木三糖、木四糖的含量。

預水解液中總木糖含量的檢測：取5 mL預水解液放入耐壓瓶中，加入174 μL、質量分數(shù)為72%的H2SO4，將耐壓瓶密封后放入油浴中，121℃下反應60 min，然后取上清液稀釋適宜倍數(shù)，按上述方法測定預水解液中的木糖含量，即為預水解液中的總木糖含量。

1.3.2 紅外光譜（FT-IR）分析

取1 mg經過冷凍干燥后得到的低聚木糖樣品，與100 mg干燥的KBr經瑪瑙研缽研磨后壓片，置于Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）（Vertex70型，德國布魯克公司）中測試，掃描范圍為250～4250 cm－1，掃描次數(shù)為16次。

1.3.3 熱穩(wěn)定性（TGA）分析

取5～10 mg經過冷凍干燥后得到的低聚木糖樣品置于坩堝中，在熱重分析儀（Q50型，美國TA儀器公司）中進行測試。測試條件：以高純度氮氣（≥99.99%）為載氣，流量為60 mL/min，以10℃/min的升溫速率從室溫升溫至600℃。

2 結果與討論

2.1 酶用量及處理時間對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

圖1 酶用量及處理時間對三級處理預水解中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過程中酶用量及處理時間對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響見圖1。由圖1中數(shù)據可知，酶用量及處理時間對三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4含量的影響較大，而對木糖含量影響較小。圖1(a)顯示，在酶用量為2 U/g時，隨著處理時間的延長，三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4的含量呈現(xiàn)先快速增加后逐漸不變的趨勢，原因可能是酶用量較低時，預水解液中酶分子數(shù)量較少，隨著處理時間的延長，酶分子與反應底物不斷結合，在處理時間為3 h時，幾乎所有的酶分子與反應底物結合，此時預水解液中低聚木糖DP2～4含量較高為12.22 g/L；之后，由于預水解液中剩余的酶分子數(shù)量更少，因此進一步延長處理時間低聚木糖含量變化不明顯。由圖1(b)、圖1(c)可知，在酶用量為5 U/g、10 U/g時，隨著處理時間的延長，三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，而且分別在處理6 h和3 h時達到最大值，分別為13.02 g/L和13.12 g/L。這是由于隨著處理時間的延長，預水解液中的聚木糖不斷被降解為低聚木糖，在處理時間分別為6 h和3 h時，幾乎所有的聚木糖轉化為低聚木糖，此時，預水解液中木糖和低聚木糖DP2～4總量分別為18.84 g/L和19.08 g/L；由于預水解液中剩余的聚木糖含量較少，因此進一步延長處理時間，預水解液中剩余的大量酶分子會進一步切割低聚木糖的糖苷鍵形成木糖，這和預水解液中木糖含量的提高是一致的。圖1(d)中數(shù)據表明，在酶用量為20 U/g時，酶處理0.67 h即可使預水解液中的低聚木糖DP2～4含量達到最大值13.1 g/L；進一步延長處理時間，低聚木糖含量不斷降低。這是由于酶用量較高時預水解液中的酶分子數(shù)量較高，酶分子與反應底物結合的機率增加。因此，較短的處理時間內酶分子即可與反應底物充分結合，有效提高了聚木糖水解生產低聚木糖DP2～4的反應速度。由以上分析可知，低酶用量和長處理時間或者高酶用量和短處理時間均可使低聚木糖DP2～4含量達到較高值。因此，考慮到實際生產成本，較優(yōu)的聚木糖酶用量為2 U/g，酶處理時間為3 h。

2.2 處理溫度對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量的影響

圖2 處理溫度對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過程中處理溫度對三級處理預水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響見圖2。圖2中數(shù)據表明，溫度是影響酶處理效果的重要因素。在處理溫度為45℃時，預水解液中低聚木糖DP2～4含量較低，這是由于溫度較低時聚木糖酶活性較低，酶反應速率較慢。升高處理溫度至55℃，預水解液中低聚木糖DP2～4含量快速提高至12.22 g/L，此時預水解液中木糖、木二糖、木三糖及木四糖含量分別為5.53、5.69、4.15和2.38 g/L，原因是升高處理溫度使反應體系中的酶分子與聚木糖分子運動加快，增加了二者之間的碰撞機會，有效地提高了酶分子-聚木糖底物絡合物轉變?yōu)榈途勰咎堑乃俣取Ｖ?，進一步升高處理溫度至60℃，預水解液中低聚木糖DP2～4的含量快速降低，這是由聚木糖酶自身的性質造成的，聚木糖酶是一種具有特殊催化活性的蛋白質，在溫度較高時酶蛋白的構象與參與酶促反應的功能團的離解狀態(tài)會發(fā)生改變，使酶分子活力降低或發(fā)生失活[17]。因此，利用聚木糖酶水解制備低聚木糖時需要嚴格控制處理溫度。綜上分析，較優(yōu)的聚木糖酶處理溫度為55℃。

2.3 酶解pH值對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過程中pH值對三級處理預水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響見圖3。

圖3 pH值對三級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

由圖3中數(shù)據可知，隨著三級處理預水解液pH值的不斷增加，低聚木糖DP2～4含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這是由于pH值可以通過改變聚木糖酶的構象進而影響酶的活性位點與底物的結合。在pH值為4.5或6.5時，聚木糖酶的構象與參與酶反應的功能團的離解狀態(tài)發(fā)生了改變，使得聚木糖酶活力下降，因此，過低或過高的pH值環(huán)境均不適合聚木糖酶水解制備低聚木糖。另外，圖3顯示，pH值對預水解液中木糖含量的影響較小，這是由于內切聚木糖酶可以選擇性地切割聚木糖主鏈的β-1,4糖苷鍵。由以上分析可知，聚木糖酶處理二級處理預水解液制備低聚木糖DP2～4的較優(yōu)pH值為5.5。

2.4 較優(yōu)處理工藝條件下不同聚合度低聚木糖DP2～4含量分布

由上述2.1～2.3分析可知，聚木糖酶處理二級處理預水解液制備富含低聚木糖DP2～4的較優(yōu)工藝條件為聚木糖酶用量2 U/g、處理時間3 h、處理溫度55℃、處理液pH值5.5。在此條件下，三級處理預水解液中木糖及低聚木糖DP2～4的含量如表3所示。

表3 聚木糖酶處理前后預水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量 g/L

由表3中數(shù)據可知，聚木糖酶處理對三級處理預水解液中木糖含量的影響較小，而對低聚木糖DP2～4含量的影響較大。經過聚木糖酶處理后，預水解液中木二糖及木三糖含量分別提高了108.4%、86.9%，而木四糖含量變化不明顯，低聚木糖DP2～4含量由原來的7.31 g/L提高為12.22 g/L，提高了67.2%。在較優(yōu)的酶處理條件下，所得三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4的含量占原始桉木預水解液中總木糖含量的56.1%。由以上分析可知，利用聚木糖酶處理桉木預水解液是制備低聚木糖較為有效的方法。

2.5 FT-IR分析

預水解液經過聚木糖酶處理后所得酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的FT-IR圖如圖4所示。由圖4可知，兩種低聚木糖樣品均在1045、894和1408 cm－1處出現(xiàn)特征吸收峰。樣品在1045 cm－1處出現(xiàn)較強的吸收峰，是由C—O的伸縮振動引起，是聚木糖主鏈的特征吸收峰[18]；894 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰是由糖單元間顯性β-糖苷鍵的振動引起；1635 cm－1處的吸收峰是由吸附水的彎曲振動引起[19]；1408 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰是由—COO－的對稱伸縮振動引起，為糖醛酸的典型特征峰[20]，這表明經過聚木糖酶處理所制備的低聚木糖產品中含有部分糖醛酸側鏈。另外圖4顯示，酶解低聚木糖在1730 cm－1處沒有出現(xiàn)特征吸收峰，這是由于Ca(OH)2處理純化預水解液過程中，堿性條件下聚木糖側鏈上的乙酰基脫落造成的[21]。

圖4 聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的FT-IR圖

2.6 TGA分析

聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的TGA圖如圖5所示。由圖5中TG曲線和DTG曲線可知，酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA圖相似。兩種低聚木糖在160℃前只發(fā)生脫水，從190℃開始發(fā)生分解，并在310℃出現(xiàn)最大質量損失峰，質量損失過程在600℃完成，之后質量損失變化不明顯。由以上分析可知，酶解所得低聚木糖熱降解過程主要分為4個階段：160℃前為第一階段，樣品吸熱使樣品中的水分蒸發(fā)，這一階段只發(fā)生物理變化；160～310℃為第二階段，在此階段內低聚木糖出現(xiàn)解聚轉變現(xiàn)象，生成不燃性氣體如CO、CO2、甲酸和乙酸等[18]；310～440℃為第三階段，在此階段內，不燃性氣體生成為可燃性氣體[19]；440℃后為第四階段，該階段主要發(fā)生炭化反應，是由C—O和C—H鍵的進一步裂解造成的[22]。由上述分析可知，利用聚木糖酶處理預水解液所制備的低聚木糖樣品具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖5 聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA分析

3 結 論

采用單因素實驗對聚木糖酶處理二級處理預水解液制備富含低聚木糖DP2～4的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化分析，并得出以下結論。

3.1 聚木糖酶用量、處理時間、處理溫度及pH值對預水解液中低聚木糖DP2～4的含量均有較大影響；低酶用量和長處理時間或者高酶用量和短處理時間均可使低聚木糖DP2～4的含量達到較高值；聚木糖酶處理預水解液制備低聚木糖DP2～4的較優(yōu)工藝條件為酶用量2 U/g、處理時間3 h、處理溫度55℃和pH值5.5，在此條件下，經過酶處理后三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4含量為12.22 g/L，與未經過酶處理的二級處理預水解液相比，低聚木糖DP2～4含量提高了67.2%。三級處理預水解液中低聚木糖DP2～4含量為桉木預水解液中總木糖含量的56.1%。

3.2 紅外光譜（FT-IR）分析表明，通過聚木糖酶處理桉木預水解液所制備的低聚木糖含有部分糖醛酸側鏈；熱重分析（TGA）顯示，經過聚木糖酶處理制備的低聚木糖具有較高的熱穩(wěn)定性。