基于 ISSR標(biāo)記的黃河下游區(qū)域魯桑地方品種遺傳關(guān)系分析

張 林,黃 勇,沈興家,劉 利,趙衛(wèi)國,強 勝

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院雜草研究室,江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,江蘇 鎮(zhèn)江 212018；

3.江蘇科技大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212018；4.國家農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點開放實驗室,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

在中國,桑 (MorusalbaL.)的栽培歷史悠久,遺傳資源十分豐富。根據(jù)地理分布可將中國桑地方品種分為 8個不同的生態(tài)類型,每個生態(tài)類型均有各自的特征,在枝條形態(tài)、葉形大小、發(fā)芽期、抗逆性等方面都有一定的差異。黃河下游區(qū)域栽培的魯?！睲orusalbavar.multicaulis(Perro tt.)Loud.〕是 8個生態(tài)類型之一,是中國北方主蠶區(qū)的代表性桑品種,也是中國桑品種資源庫的重要組成部分[1-2],主要分布在山東省蠶區(qū),也包括河北省的部分蠶區(qū)。

ISSR分子標(biāo)記具有簡單和重復(fù)性好的優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于桑樹的分子生物學(xué)研究。其原理是根據(jù)植物中廣泛存在簡單重復(fù)序列(SSR)的特點,利用在植物基因組中常出現(xiàn)的 SSR本身設(shè)計引物,用于擴增的引物通常具有 16～18個堿基,一般由 1～4個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個非重復(fù)的錨定堿基組成,無需預(yù)先克隆和測序。目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。

目前,有關(guān)桑樹 ISSR分子標(biāo)記的研究較多,研究方向主要集中于桑樹遺傳多樣性和親緣關(guān)系方面,研究對象主要是不同品種以及不同生態(tài)類型。V ijayan等[3-5]采用 ISSR分子標(biāo)記對印度的桑屬 (MorusL.)栽培品種、高產(chǎn)品種及野生種進(jìn)行了遺傳多樣性分析；Awasthi等[6]采用 ISSR分子標(biāo)記對桑樹的部分栽培品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析,研究結(jié)果顯示品種間差異明顯；趙衛(wèi)國等[7-14]利用 ISSR分子標(biāo)記對桑樹的栽培種和野生種、二倍體、同源四倍體、選育品種、芽變類型以及 8個不同生態(tài)類型進(jìn)行了遺傳多樣性分析及分子系統(tǒng)學(xué)研究；Kar等[15]利用與某些生化性狀有關(guān)的 ISSR標(biāo)記分析了印度桑樹遺傳資源的遺傳變異和親緣關(guān)系。但迄今為止,對桑樹同一生態(tài)類型不同地方品種間親緣關(guān)系的研究卻較少,對魯桑地方品種遺傳多樣性的研究則未見報道。

作者利用 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對黃河下游區(qū)域(河北省和山東省)46個魯桑地方品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,以期在分子水平上研究魯桑不同地方品種的遺傳關(guān)系,為魯桑種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的建立及品種鑒定提供科學(xué)依據(jù)。這對于魯桑種質(zhì)資源的保護(hù)、重要農(nóng)藝性狀基因的發(fā)掘和利用都具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的 46個魯桑地方品種均種植于江蘇鎮(zhèn)江的國家桑樹資源圃,原產(chǎn)地及各地方品種的主要性狀見表 1。采集當(dāng)年生嫩葉供試。

實驗使用的 ISSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,TaqDNA聚合酶、PCR buffer、dNTPs以及 DL2000 m arker均購自寶生物工程 (大連)有限公司。

1.2 方法

隨機采集各地方品種當(dāng)年生新鮮嫩葉,用 CTAB法[16]提取總DNA,并置于 -70℃條件下保存、備用。用魯桑品種‘大雞冠’的總DNA對23個 ISSR引物進(jìn)行初步篩選,選擇擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且擴增結(jié)果穩(wěn)定的 15個引物,用于 46個魯桑地方品種總DNA的 ISSR擴增反應(yīng)。

ISSR-PCR反應(yīng)體系總體積為 15μL,包括 10 ng模板 DNA、0.7μL引物 (10 ng·μL-1)、1 UTaqDNA聚合酶、1.5μL 10×PCR buffer和 0.25μLdNTPs(200μmo l·L-1),用純水補足至 15μL。

ISSR-PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性 2 m in；然后于 94℃變性 40 s、40℃～60℃退火 45 s(根據(jù)每個引物的 Tm值設(shè)定具體退火溫度)、72℃延伸90 s,共 36個循環(huán)反應(yīng)；最后于 72℃延伸 7m in。擴增產(chǎn)物置于4℃條件下保存。

ISSR-PCR擴增產(chǎn)物通過用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1％的瓊脂糖凝膠(含質(zhì)量濃度 0.5μg·mL-1EB)進(jìn)行電泳檢測,并對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。

表 1 供試 46個魯桑地方品種的原產(chǎn)地及主要性狀Tab le 1 The or ig in sand m a in characters of for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)L oud.for tested

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照清晰易辨、重復(fù)、穩(wěn)定的原則對擴增條帶進(jìn)行統(tǒng)計,有條帶的記為“1”、同一位置沒有條帶的則記為“0”,以此形成 0、1數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計每個引物擴增出的條帶數(shù)和其中的多態(tài)性條帶數(shù),并計算多態(tài)性條帶百分率。按照 Nei等[17]的方法,利用 Popgene 3.0 (PHYL IP 3.5版本)系統(tǒng)分析軟件計算各地方品種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離,并采用類平均數(shù)聚類方法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建魯桑地方品種間的遺傳關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 ISSR擴增結(jié)果

經(jīng)過初篩實驗,從 23個 ISSR引物中篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且擴增結(jié)果穩(wěn)定的 15個引物用于 46個魯桑地方品種指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析,引物序列和擴增結(jié)果見表 2,引物ISSR04的擴增圖譜見圖 1。

由表 2可見,在篩選出的 15個引物中,12個引物(ISSR03～I(xiàn)SSR07和 ISSR09～I(xiàn)SSR15)含有 2個堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位,2個引物 (ISSR02和 ISSR08)含有 3個堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位,1個引物 (ISSR01)含有 4個堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位。通過 PCR反應(yīng),共擴增出 109條清晰條帶,其中多態(tài)性條帶 81條,多態(tài)性條帶百分率為 74.31％,平均每個引物擴增的條帶數(shù)為 7.3條,平均每個引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)為 5.4條。不同引物擴增的條帶數(shù)為 5～11條,引物 ISSR11擴增出的條帶數(shù)最少,僅有 5條；引物 ISSR05擴增出的條帶數(shù)最多,為 11條。各引物擴增出的片段大小為 250～2 000 bp(圖 1)。

表2 用于46個魯桑地方品種總DNA ISSR標(biāo)記分析的引物序列及擴增結(jié)果Tab le 2 Pr im er sequence and am p lifica tion resu lts of ISSR m arker ana lysis of tota l DNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var. m u lticau lis(Perrott.)Loud.

2.2 基于 ISSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果

以 46個魯桑地方品種總DNA的 ISSR-PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生的 81條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),計算各地方品種間的遺傳相似系數(shù),結(jié)果表明,46個地方品種間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為 0.602～0.898,平均遺傳相似系數(shù)為 0.750。由于實驗所涉及的魯桑地方品種均為山東省和河北省典型的地方品種,這 2個省份毗鄰且不排除相互引種的可能性,因此,計算出的平均遺傳相似系數(shù)相對偏大。其中,品種‘萊蕪接?！汀嗤┥！约捌贩N‘小雞冠’和‘三岔黃魯’間的遺傳相似系數(shù)最大,為 0.898,表明它們之間的遺傳距離最小,親緣關(guān)系很近；來源于河北的品種‘冀豐’和山東的品種‘新泰打?！倪z傳相似系數(shù)最小,僅為0.602,表明二者間的遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

基于魯桑不同地方品種間的遺傳相似系數(shù)、采用UPGMA法進(jìn)行了聚類分析,結(jié)果見圖 2。由圖 2可見,在遺傳相似系數(shù)約 0.637處,供試的 46個魯桑地方品種 (40個為山東地方品種,6個為河北地方品種)被劃分成 2大類。其中,品種‘冀豐’和‘冀黃魯選’為河北省地方品種,且均為雌株,被聚在一起成為第 1大類；其余 44個地方品種聚為第 2大類,該大類包括 40個來自山東省的魯桑地方品種和 4個來自河北省的魯桑地方品種。綜合各地方品種的產(chǎn)地、性狀及遺傳相似性系數(shù),可進(jìn)一步將第 2大類的 44個地方品種細(xì)分為9個亞類,分別為A、B、C、D、E、F、G、H和 I亞類。其中,A、E、F、G、H和 I亞類共包含了36個地方品種,全部為原產(chǎn)山東省的魯桑地方品種,占供試的山東魯桑地方品種數(shù)(40個)的 90％；劃歸B、C和D亞類的地方品種均包含了分別來自山東省和河北省的地方品種,其中,B亞類包含了來自河北深縣的品種‘碗?！蛠碜陨綎|蒙陰的品種‘紅條擗?！?C亞類包含了來自河北寬城的品種‘桲欏桑’、來自河北深縣的品種‘深縣黃魯’和來自山東青州的品種‘益都大白條’,D亞類包含了來自河北深縣的品種‘大碗?！约皝碜陨綎|臨朐的品種‘選 792’和‘黃魯頭’；此外,E亞類較為特殊,僅包含 1個品種,即產(chǎn)自山東蒙陰的品種‘白條擗桑’,是 46個供試品種中惟一的 1個三倍體品種,在遺傳特性上具有明顯的特殊性。

圖1 引物 ISSR04對46個魯桑地方品種總DNA的 ISSR擴增圖譜Fig.1 ISSR am p lifica tion pa ttern of tota lDNA from for ty-six loca l var ietiesofM o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.am p lified by pr im er ISSR04

圖2 基于46個魯桑地方品種總DNA ISSR標(biāo)記分析的 UPGM A聚類圖F ig.2 UPGM A cluster dendrogram based on ISSRm arker ana lysis of tota lDNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.

3 討論和結(jié)論

買買提依明等[18]對 16個新疆地方桑樹品種資源(包括 2個引進(jìn)的品種)進(jìn)行了 RAPD標(biāo)記研究,發(fā)現(xiàn)新疆特有的桑樹品種資源藥桑與引進(jìn)的品種‘西慶1號’和‘西慶 2號’間的指紋圖譜差異較大,表明不同桑樹地方品種的遺傳關(guān)系與其地理分布具有一定的相關(guān)性。在本研究中,利用 ISSR分子標(biāo)記對 46個魯桑地方品種進(jìn)行進(jìn)一步的劃分,結(jié)果顯示,魯桑地方品種的各大類和各亞類與各地方品種的地理分布具有一定的關(guān)系,地理位置相近的品種遺傳相似系數(shù)較大,一般被聚在一起。例如,來自山東各地的 40個魯桑地方品種均被聚入第 2大類中,形態(tài)特征相似的魯桑地方品種聚為同一個亞類,且很多來自同一個縣。其中,A亞類中的‘大雞冠’和‘小雞冠’都為來自山東臨朐的魯桑地方品種,均為雌雄同株；D亞類中的‘選 792’和‘黃魯頭’以及 G亞類中的‘雞冠一生子’和‘黑魯桑’也都為來自山東臨朐的魯桑地方品種,且形態(tài)特征相似；I亞類中的‘小黃?！汀绿┐蛏！簿鶠閬碜陨綎|新泰的魯桑地方品種。但B、C和D亞類分別由來自山東和河北的魯桑地方品種組成,這一現(xiàn)象很可能與不同產(chǎn)地間的相互引種有關(guān)。

使用 15個 ISSR引物對 46個來自山東和河北的魯桑地方品種總DNA進(jìn)行擴增反應(yīng),共擴增出 81條多態(tài)性條帶,多態(tài)性條帶百分率為 74.31％,說明供試的魯桑地方品種間具有豐富的遺傳多樣性。46個魯桑地方品種間的遺傳相似系數(shù)為 0.602～0.898,數(shù)值偏大,這可能是由于河北和山東兩省距離較近,且可能存在相互引種的現(xiàn)象?；?ISSR分子標(biāo)記對供試的 46個魯桑地方品種進(jìn)行聚類分析,獲得的分組結(jié)果與不同品種的地理分布有一定的相關(guān)性,說明魯桑地方品種間的親緣關(guān)系與地理分布的遠(yuǎn)近有關(guān)。

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