探討醫(yī)用膠細胞毒性試驗方法的選擇

田小俊 田勝慧 鄭保婷 徐紅蕾 廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510663）

探討醫(yī)用膠細胞毒性試驗方法的選擇

田小俊 田勝慧 鄭保婷 徐紅蕾 廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510663）

目的：分析不同細胞毒性試驗方法對醫(yī)用膠細胞毒性評價的影響。方法：用浸提液法、直接接觸法、間接接觸法對α-氰基丙烯酸酯類粘合劑和多糖纖維素醫(yī)用膠液進行細胞毒性試驗，比較不同試驗方法對其細胞毒性評價的影響。結果：同種樣品采用不同試驗方法得出的細胞毒性結果不同。結論：細胞毒性試驗方法的選擇應根據樣品的物理性質和用途，盡量模擬臨床使用情況進行選擇。

醫(yī)用膠 細胞毒性 試驗方法

細胞毒性試驗具有簡便、快速、敏感性高的特點，是醫(yī)療器械進行臨床安全性評價前的首選和必選試驗項目。GB/ T 16886.5-2003規(guī)定了三類體外細胞毒性試驗：浸提液試驗、直接接觸試驗、間接接觸試驗[1]。GB/T 16886.12-2005也規(guī)定了細胞毒性試驗所要遵循的樣品制備和參照樣品的選擇要求，指出不同物理形態(tài)的醫(yī)療器械應按照以上兩份標準要求選擇合適的樣品制備方法和細胞毒性試驗方法[2]。

對于以α-氰基丙烯酸酯類粘合劑為代表的原位聚合類產品，和以多糖纖維素醫(yī)用膠液為代表的液態(tài)產品，如何按照標準要求，選擇合適的試驗方法才能科學合理地評價其細胞毒性？本文做了一系列對比實驗，并對如何選擇這兩類產品的細胞毒性試驗方法進行了探討。

1.材料與方法

1.1 材料

試驗樣品：α-氰基丙烯酸酯快速醫(yī)用膠（1號）；α-氰基丙烯酸酯醫(yī)用粘合劑（2號）；多糖纖維素醫(yī)用膠液（3號）。

細胞：ATCC CCL1小鼠成纖維細胞（中科院上海細胞與生物化學研究所）。

主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），小牛血清（Gibco），瓊脂培養(yǎng)基，中性紅染色液。

1.2 方法

1.2.1 浸提液法：①樣品浸提液制備：成膜后浸提法。將樣品均勻的滴在直徑9 cm平板上，按6 cm2/mL的比例充入不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，（37±1）?C下浸提（24±2）h備用。直接浸提法。將樣品分別按0.2g/mL或0.1g/mL的比例滴入不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，靜置10 min后，（37±1）?C下浸提（24±2）h備用；②空白對照液：RPMI-1640培養(yǎng)基；③陰性對照液：高密度聚乙烯；④陽性對照：5g/L苯酚溶液。⑤試驗方法：按照GB/ T 14233.2-2005規(guī)定的MTT試驗方法進行。將1×104/mL細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL[3]。置CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。加入樣品浸提液，每孔100 μL，置CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)72h。⑥細胞毒性分級：每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后棄去孔內液體，加入150 μL DMSO，在酶標儀570 nm和630 nm雙波長下測定吸光度（OD值）。按下式計算細胞相對增殖率（RGR）：

注：RGR：相對增殖率，%；A：供試品組（陰性組、陽性組）吸光度；A0：空白對照組吸光度。

根據GRG按表1分級標準判定。陰性對照組的反應不大于1級，陽性對照組的反應至少為3級時，判定結果可靠。

表1. MTT法細胞毒性反應分級

1.2.2 直接接觸法：①樣品制備：按照GB/T 16886.5-2003規(guī)定，將濾紙片裁剪成表面積約100mm2的片狀，沾取適量液體樣品作為試驗樣品；②陰性對照：將濾紙片裁剪成表面積約100mm2的片狀，沾取適量RPMI-1640培養(yǎng)基作為陰性對照；③陽性對照：將表面積約100mm2的濾紙片浸透20%苯酚溶液作為陽性對照。④試驗方法：將細胞按1.5×105/mL的密度接種于直徑35mm的培養(yǎng)皿，置5%的CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。棄去原培養(yǎng)液，加入2mL新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中央部位的細胞層上放置一片試驗樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h。⑤細胞毒性分級/計分：根據GB/T 16886.5-2003給出的細胞毒性定性評價計分方法分級（見表2）。

表2. 間接接觸法和直接接觸法試驗細胞毒性反應分級

1.2.3 間接接觸法：樣品制備、陰性對照、陽性對照及細胞毒性分級/計分同直接接觸法。試驗方法：將細胞按1.5×105/mL的密度接種于六孔板，每孔2 mL。置5%的CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。棄去培養(yǎng)基，取瓊脂培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿。每皿加入1 mL中性紅染色液，置培養(yǎng)箱中避光保持20 min。棄去多余染色液，將試驗樣品放在瓊脂表面。每孔放1個樣品，每組3孔，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h。培養(yǎng)結束后，在培養(yǎng)皿底部標出試驗樣品輪廓，除去瓊脂表面試樣。將培養(yǎng)皿置顯微鏡下觀察細胞區(qū)域褪色現象。

2.結果

浸提液法細胞相對增值率及細胞毒性評級見表3，直接接觸法和間接接觸法細胞毒性評級見表4。

3.討論

表3. 浸提液法細胞相對增值率及細胞毒性評級

表4. 直接接觸法和間接接觸法細胞毒性評級

3.1 同種方法不同樣品細胞毒性結果分析

從表3可以看出，1號、2號、3號樣品無論是成膜后浸提，還是直接浸提，1號樣品的細胞相對增值率RGR均低于4%，反應分級為4級，表現出重度細胞毒性。這可能是由于1號樣品含有較多的小分子添加劑、單體或低聚物，浸提液中含有較多的此類物質，細胞培養(yǎng)過程中，嚴重破壞細胞膜，導致細胞凋亡或影響細胞增殖。

從表3也可以看出，無論是哪種浸提方式，1號、2號、3號樣品的細胞毒性依次減小。這說明，醫(yī)用膠液的組成成分會直接影響細胞毒性結果，后續(xù)需對產品組成成分做進一步分析，證實不同成分物質對產品細胞毒性的影響。另外，表3結果還表明，同為α-氰基丙烯酸酯類醫(yī)用膠的1號和2號樣品比多糖纖維素醫(yī)用膠液的3號樣品細胞毒性大，這與多糖類高分子材料比聚丙烯酸酯類高分子材料具有更好的生物相容性有關。同時，兩類產品的主要用途也有所差別，多糖生物醫(yī)用膠液主要用于創(chuàng)面的沖洗，起到潤滑隔離及生物屏障作用，從而利于創(chuàng)面組織的修復，而氰基丙烯酸酯類醫(yī)用膠主要利用其快速粘結特點，封閉創(chuàng)面，促進創(chuàng)面修復。

從表3還可以看出，2號、3號樣品的細胞毒性隨浸提液濃度的降低而降低。這說明浸提時樣品比例的選擇對試驗結果產生直接影響，實驗時務必按照標準要求，或經驗證的合理的浸提比例進行浸提，科學合理有效的評價產品的細胞毒性。

3.2 不同方法同種樣品細胞毒性結果分析

對比分析表3和表4可以看出，同種樣品不同細胞毒性試驗方法的結果中，采用浸提液法試驗測得的細胞毒性最大，采用間接接觸法測得的細胞毒性最小。這表明，細胞毒性試驗方法的選擇對產品細胞毒性評價起決定性作用，也間接表明科學合理有效的評價醫(yī)用膠細胞毒性的關鍵在于采用合適的試驗方法。

在評價原位聚合的醫(yī)療器械產品（如醫(yī)用粘合劑）時，應盡量模擬材料的使用條件對樣品進行試驗，以提供治療過程中聚合物的反應組分的潛在毒性信息。試驗方法中使用浸提液來評價原位固化的材料，浸提過程應從材料被置于原位固化點開始[4]。但是，這種方法所得的試驗液含有比臨床應用更高濃度的α氰基丙烯酸辛酯單體、低聚物，以及添加劑醫(yī)用級聚甲基丙烯酸甲酯，這些物質是產生細胞毒性的主要物質，雖然能最大限度地提供治療過程中醫(yī)用膠的潛在細胞毒性信息，但所得的細胞毒性試驗結果不能完全代表產品在臨床使用過程中產生的細胞毒性。

3.3 細胞毒性試驗方法的選擇

GB/T 16886.5-2003醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗 規(guī)定的體外細胞毒性試驗分為三類：浸提液試驗、直接接觸試驗、間接接觸試驗。三種方法對樣品的制備方法要求不同，具體操作也有所差別，但基本都是對材料中存在的可溶出的毒性物質進行試驗，一般包括原料單體、低分子聚合物、塑化劑、催化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等。試驗方法直接決定了樣品制備、細胞制備、樣品/細胞/浸提液之間的接觸方法等。三類方法各具特點，也有各自的局限性[5,6]。試驗方法的選擇需要盡量模擬樣品實際使用情況或嚴于樣品實際使用情況，達到有效評價樣品細胞毒性的目的。對于醫(yī)用膠類原位聚合產品而言，直接接觸法為模擬臨床使用的最佳細胞毒性評價方法，但任何單項試驗結果都不宜作為推斷樣品是否安全的唯一依據。

細胞毒性試驗方法的選擇對產品細胞毒性評價起決定性作用，科學合理有效的評價醫(yī)用膠細胞毒性的關鍵在于采用合適的試驗方法。在評價醫(yī)用粘合劑這類原位聚合產品時，應盡量模擬材料的使用條件對樣品進行試驗。

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局. GB/T 16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學評價 第5部分:體外細胞毒性試驗[S]. 北京:中國標準出版社, 2003.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學評價 第12部分:樣品制備與參照樣品[S]. 北京:中國標準出版社, 2005.

[3] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分:生物學試驗方法[S]. 北京:中國標準出版社, 2006.

[4] 奚廷斐. 醫(yī)療器械生物學評價[M]. 北京:中國質檢出版社, 中國標準出版社, 2012:94.

[5] 李瑞, 王青山. 生物材料生物相容性的評價方法和發(fā)展趨勢[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2011,15(29):5471-5474.

[6] 賈文英, 史弘道. 細胞毒性試驗評價醫(yī)用裝置生物相容性的研究概況[J]. 實用美容整形外科雜志, 2001,12(5):253-255.

The Research of Cytotoxicity Test Methods Selection of Medical Adhesive

TIAN Xiao-jun TIAN Sheng-hui ZHENG Bao-ting XU Hong-lei Guangdong Medical Devices Quality Surveillance and Test Institute (Guangdong Guangzhou 510663)

Objective: to analyze the impact of different cell toxicity test methods on the cytotoxicity of medical adhesive. Methods: in vitro cytotoxicity of cyanoacrylate adhesive and polysaccharide cellulose medical solution were tested by the extract liquid method , the direct contact method and the indirect contact method, then comparing the results of different testing methods. Results: the cytotoxicity results of same sample were different by using different test methods. Conclusion: the in vitro cytotoxicity test methods should be selected according to the physical properties of the sample and usage, to simulate the clinical usage as far as possible.

medical adhesive, cytotoxicity, test method

1006-6586(2017)11-0058-03

R197.39

A

2017-02-23

快速醫(yī)用膠生物安全耐受性檢測方法研究（廣東省科技計劃項目，項目編號：2012B061700112）。