活性氧簇的第一道防線

　　簡介
　　
　　皮膚是抵御環(huán)境侵害的第一道防線。由于暴露于日曬，氧和有害化學(xué)物質(zhì)，皮膚的完整性受到了影響。這些皮膚外來的侵害主要源于自由基的形成。如超氧化陰離子、過氧化氫、一氧化氮和羥基自由基，為常見的活性氧簇或稱為ROS，是引起發(fā)炎、刺激、皮膚變色和內(nèi)在老化的主要原因。生活在陽光、氧環(huán)境中需重點防護活性氧簇。
　　皮膚本身已經(jīng)能夠?qū)苟喾NROS的侵襲。在這些防護中主要有很多不同的酶，如超氧化歧化酶(能將超氧化陰離子基團轉(zhuǎn)化為過氧化氫)和過氧化氫酶(能夠?qū)⑦^氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣)。但是，其中一個活性氧簇——一氧化氮，在皮膚損壞和內(nèi)在老化方面起的作用一直被忽視(至少說在健康皮膚上)。其原因很簡單，沒有特殊的酶可以調(diào)節(jié)過量的一氧化氮。這是不是意味著這種活性氧可以肆無忌憚地橫行于皮膚?
　　事實并非如此。在血液中，一氧化氮是有效的血管舒張劑，控制血管的舒張和收縮直到真皮層的微毛細血管。當(dāng)一氧化氮的濃度超出平衡狀態(tài)時，人體會通過氧運輸?shù)鞍?、血紅細胞中的血紅蛋白，排除多余的一氧化氮。相似的，在神經(jīng)系統(tǒng)里面，多余的活性氧用神經(jīng)球蛋白進行處理，在肌肉中，氧氣運輸和自由基控制是通過肌紅蛋白進行處理。身體在所有的關(guān)鍵部位使用這些球蛋白，那皮膚是不是可能使用相似的防御機制?最近一種新型球蛋白——細胞球蛋白(普遍存在于身體)的發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了一種新的皮膚抵御ROS的機制。
　　有趣的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)所有的綠色植物同樣含有球蛋白，其功能也是作為傳輸氧氣和保護植物對抗內(nèi)部ROS。以下將描述球蛋白在植物和人體中的作用，著重于植物和大多數(shù)熱血哺乳動物內(nèi)球蛋白的相似點。然后介紹一種植物球蛋白一豆血紅蛋白，能夠代替人體球蛋白控制人體內(nèi)的ROS，特別是一氧化氮。對一氧化氮的控制會影響一些主要的皮膚反應(yīng)如發(fā)炎，刺激和黑色素形成。最后會討論到球蛋白的一種可能的作用，特別是細胞球蛋白，作為細胞的氧氣運輸體并促進膠原蛋白合成中關(guān)鍵酶的合成。
　　
　　細胞蛋白
　　
　　人體內(nèi)含量豐富的球蛋白，它是通過不同氨基酸包圍著一個含有鐵活性中心的獨特的“球形”蛋白。在球狀蛋白的折疊環(huán)境中，鐵元素以Fe⁺²(亞鐵離子)或Fe⁺³(三價鐵離子)的形式存在，而且這種金屬元素在這兩種形態(tài)中往復(fù)循環(huán)，使氧氣和二氧化碳在血液中運輸?shù)奶厥庑袨槌蔀榭赡?。然而球蛋白并不只是簡單地結(jié)合氧氣和二氧化碳，更能很好的結(jié)合其他一些小分子如一氧化碳和氰根離子。因此，有充分的理由確定球蛋白能結(jié)合一氧化氮。
　　截止2002年體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的球蛋白只有三種：血紅蛋白(在血紅細胞中)、肌紅蛋白(在肌肉細胞中)和神經(jīng)球蛋白(在神經(jīng)細胞中)。在2002年，兩個獨立的實驗室?guī)缀跏峭瑫r報告發(fā)現(xiàn)了人體內(nèi)的第四種球蛋白。這種蛋白質(zhì)被Burmester等命名為“細胞球蛋白”。有趣的是，不像其他三種已經(jīng)被確認(rèn)的球蛋白，細胞球蛋白存在于許多不同類型的部位和組織中。細胞球蛋白存在的作用和作用機制目前還未發(fā)現(xiàn)。然而，BermesterTfflHargrove(該蛋白的共同發(fā)現(xiàn)者)都認(rèn)為細胞球蛋白很可能在控制活性氧方面起作用，可能在細胞處于缺氧環(huán)境(即氧氣缺乏)下的時候促進氧氣的運輸。最近，Burmester等表示在老鼠皮膚的成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)細胞球蛋白，雖然這些發(fā)現(xiàn)還有待證實。Burmester認(rèn)為，可能球蛋白除了控制ROS、傳輸氧氣外，還能影響到聚-4羥化酶——成纖維細胞中膠原蛋白合成所需的酶。
　　
　　固氮作用——植物和微生物的共生關(guān)系
　　
　　植物同樣產(chǎn)生球蛋白。事實上，如圖1所見，在豆科植物如大豆和蓮屬植物中形成的球蛋白和哺乳動物的球蛋白——肌紅蛋白驚人的相似。同樣豆血紅蛋白(六價固定鐵核心結(jié)構(gòu))也與人類細胞球蛋白有著接近的相似性。
　　
　　有一類特殊植物——豆科植物(有將近850個屬和1，800種)已經(jīng)引發(fā)了科學(xué)想象。隨著進化，豆科植物根部已經(jīng)能夠適應(yīng)微生物如根瘤菌。在共生關(guān)系中，微生物鉆入植物的微根毛中，建立小巢成為“共生體”。在環(huán)境中，微生物能夠被保護不受氧環(huán)境的損害。在共生體中，微生物利用植物的資源作為營養(yǎng)、水分、維他命、礦物質(zhì)和其他生命必須組分生長。作為回報，微生物提供給植物必須的含氮肥，如氨和硝酸鹽——固定大氣中的氮氣和轉(zhuǎn)化這種氣體成為如氨(一種常見農(nóng)業(yè)肥料)之類的有用肥料。
　　豆科植物儲存養(yǎng)料形成必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、碳水化合物和其他生長生存必須的關(guān)鍵組分。固氮是地球氮循環(huán)重要的環(huán)節(jié)。沒有它，這個星球上就不可能有人類生命的存在。人是無法在氮氣含量高達80％的大氣中生存的。
　　
　　豆血紅蛋白
　　
　　在固氮作用中重要的酶是固氮酶：它對氧氣和活性氧的存在十分敏感。所以當(dāng)微生物還需要氧氣生存，生產(chǎn)ATP和消耗養(yǎng)料的時候，這種微小有機體已經(jīng)進化出限制多e1w9ltnmh6MZpgHgvEzMFb+JkiEwtizWU376AzVtR7I=余氧氣和ROS這些可能損害固氮酶的機制了。這種微生物促使植物合成許多不同的保護性組分，包括維生素、抗氧化劑、酶(如超氧化歧化酶)、植物生長調(diào)節(jié)因子(如激動素)和黏多糖這些或是直接作用于活性氧，或是通過一些方式阻止活性氧進入共生體。防護性的“生態(tài)庫”中的一種主要成分是一種獨特的球形蛋白，稱為“豆血紅蛋白”。如在前面提到的，豆血紅蛋白具有和人類球蛋白驚人相似的結(jié)構(gòu)。
　　
　　豆科植物根瘤的分離比較簡單，大量的共生體可以在冷凍條件下長期保存。用水萃取浸軟的共生小體后，可生產(chǎn)一種新的能夠應(yīng)用于部分化妝品的原料。用這種方法，奧麒個人護理品部門已經(jīng)開發(fā)出兩種新的源自大豆共生體和百脈根共生體的共生體提取物。其他的豆科植物目前仍在研究中。由于這種提取液是來自植物的根部，它結(jié)合了微生物和與其共生的植物提供的生物活性組分。因此可以預(yù)期，這些提取物中的許多活性組分或許相似，但是由于每種植物的不同，因此每種不同植物共生體提取物的精確成分也不同。同樣，植物生長的土壤不同，可能導(dǎo)致形成獨特的取決于植物生長地的活性原料。大豆在許多國家普遍種植，在美國尤其廣泛，百脈根(Lotus japonicus)則主要在亞洲地區(qū)生長。然而，所有固氮共生體普遍含有球蛋白，特別是豆血紅蛋白。隨后研究發(fā)現(xiàn)，這種高含量生物活性提取物被證明是過剩一氧化氮自由基的強力清除者。
　　
　　大豆根瘤提取物
　　
　　一種提取自大豆共生體的提取物(INCI名稱：大豆[Glycine max]共生體提取物)，豆血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)含量在0.05和0.3mg/ml之間，提供獨特的一氧化氮清除功能?？寡趸锇b以及保濕成分，可以進一步增強作為預(yù)防皮膚光老化原料的功能性。體外實驗：完整厚度組織模型實驗方法
　　人類完整厚度組織模型提供一種確定產(chǎn)品在皮膚生理系統(tǒng)的功效和活性成分滲透角質(zhì)層的評估。使用MatTek EpiDerm EFT-200檢驗1％的大豆根瘤提取物對眾多的導(dǎo)致亞臨床紅斑病的關(guān)鍵酶的影響。使用紫外線照射作為這些酶的激活劑和一氧化氮產(chǎn)生的刺激源。使用ELISA技術(shù)，幾個刺激的關(guān)鍵標(biāo)志酶包括IL-alpha，TNF-alpha和PGE2被檢出。此外，導(dǎo)致皮膚膠原蛋白和彈性蛋白分解的膠原酶，如活性MMP-1，同樣被檢出。所有的這些生化信號都源于UV照射和一氧化氮上調(diào)。該組織模型同樣可以檢驗實驗樣品引起的任何細胞毒性和實驗樣品控制一氧化氮的能力。
　　UV照射以及UV照射和1％大豆根瘤提取物對完整厚度組織的作用包括了酶反應(yīng)、組織存活能力和一氧化氮的生成。“上升”顯示所測量的活性在統(tǒng)計數(shù)據(jù)上的顯著增加，“下降”顯示所測量的活性的減少。UV刺激組織的數(shù)據(jù)與無刺激對照物相比較，1％大豆根瘤提取物處理組織的數(shù)據(jù)與刺激組織相比較。
　　
　　
　　結(jié)果和討論
　　實驗結(jié)果如表格1中所示。數(shù)據(jù)顯示將組織用紫外光照射導(dǎo)致一氧化氮自由基增加，細胞的存活能力下降，增加刺激級聯(lián)酶和膠原酶的生成。使用1％的大豆根瘤提取物控制了三種紅斑標(biāo)志酶中的其中兩種的形成，并影響膠原酶的產(chǎn)生。此外，數(shù)據(jù)顯示該提取物能夠減少由UV照射而形成的組織中一氧化氮的產(chǎn)生。
　　
　　體內(nèi)實驗
　　方法
　　進行體內(nèi)實驗證明大豆根瘤提取物在使用1 MED的uV-B照射后的抗刺激作用。利用多普勒激光儀測量亞臨床紅斑病的皮膚微循環(huán)，該實驗方法是被認(rèn)為對測量皮膚中亞臨床改變最準(zhǔn)確的方法。實驗方案包括如下應(yīng)用：未處理部位，安慰劑(水和凝膠成分)，預(yù)防部位即在UV照射前涂抹含1％大豆根瘤提取物的載體，即UV照射后立即涂抹相同的實驗產(chǎn)品和UV照射后2小時涂抹實驗產(chǎn)品。微循環(huán)的增加和亞臨床紅斑的增加相關(guān)，同時微循環(huán)的減少預(yù)示著亞臨床紅斑的減少。
　　結(jié)果
　　圖2說明24小時測量值和12小時測量值的不同的實驗數(shù)據(jù)，提供了在12小時自然康復(fù)過程中減少紅斑程度。
　　
　　討論
　　以上的體外和體內(nèi)實驗結(jié)果支持關(guān)于大豆根瘤提取物活性機制和主要活性組分…豆血紅蛋白的理論。由體內(nèi)和體外實驗數(shù)據(jù)可以看出豆血紅蛋白能夠控制由uV刺激產(chǎn)生的NO。如果在一氧化氮自由基形成前使用該活性物質(zhì)，豆血紅蛋白有效抑制NO，最大限度減少紅斑。如果輻射后立即使用該活性物質(zhì)，紅斑的減少仍然明顯，但是不如輻射時有該物質(zhì)存在明顯。在輻射過后幾個小時后使用大豆根瘤提取物降低了該產(chǎn)品的有效性。這些數(shù)據(jù)支持大豆根瘤提取物中活性原料的結(jié)論，即該活性原料為豆血紅蛋白，一種強效自由基清除劑，但是它在皮膚中自由基產(chǎn)生或是皮膚自然防護機制開始清除多余自由基之初就必須存在。
　　大豆根瘤提取物能夠使UV光照射導(dǎo)致的刺激過程中產(chǎn)生的自由基最少化。減少一氧化氮自由基的產(chǎn)生能夠幫助減輕由高度uV照射皮膚引起的紅斑(亞臨床紅斑)。紅斑的減少能夠幫助預(yù)防由UV輻射引起的長期負(fù)面作用一包括光老化，皺紋和松垂。
　　
　　百脈根根瘤提取物
　　
　　最近得知，黑色素合成的一種機制是當(dāng)UV-B刺激一氧化氮合成酶的形成時，由一氧化氮自由基的形成引發(fā)酶階式反應(yīng)開始，酶將精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，釋放出一氧化氮。一氧化氮自由基的形成通過“NO-cGMP”途徑上調(diào)cGMP。最后，cGMP使酪氨酸酶上調(diào)，酪氨酸酶促進DOPA通過一種蛋白質(zhì)激酶c途徑形成黑色素的。該過程的關(guān)鍵是鳥苷酸環(huán)化酶，一種血紅素基的酶，能夠結(jié)合一氧化氮上調(diào)eGMP。
　　百脈根根瘤菌的提取物(INCI名稱：百脈根共生體提取物)被發(fā)現(xiàn)含有大約0.5-0.7mg／ml的豆血紅蛋白。從蓮屬共生體提取的豆血紅蛋白能夠與鳥苷酸環(huán)化酶競爭結(jié)合一氧化氮，通過控制cGMP的上調(diào)減緩酪氨酸酶的形成，如圖3所示。
　　
　　體外實驗：人類成纖維細胞中cGMP的產(chǎn)生
　　方法
　　使用人類真皮成纖維細胞，用一個常用的一氧化氮給予體Spermine NONOate引發(fā)UV-B照射的特征產(chǎn)物一氧化氮(15)。使用ELISA技術(shù)確定真皮成纖維細胞中產(chǎn)生的cGMP含量。
　　結(jié)果
　　應(yīng)用ELISA測量細胞中的cGMP濃度，結(jié)果證實了百脈根共生體提取物能夠下調(diào)cGMP的生成，使用10％的濃度時候能夠使cGMP的含量恢復(fù)到正常水平(圖4)。
　　
　　
　　體外實驗：在組織模型中測量黑色素形成
　　方法
　　cGMP下調(diào)被認(rèn)為百脈根共生體提取物可能能夠改善膚色，該假設(shè)被體外實驗進一步證實，該體外實驗使用的組織模型為MatTek(Ashland，MA)的Melanoderm(黑人皮膚)。該組織支架由成纖維細胞和角化細胞和不同的角質(zhì)層(其中的黑素細胞嵌入淺層真皮層)組成。在該組織的角質(zhì)層表面使用實驗樣品，樣品必須透過表層滲入組織的深層才能發(fā)揮功效。
　　結(jié)果和討論
　　在Melanoderm模型上連續(xù)每天使用10％濃度的百脈根共生體提取物，10天后測量黑色素含量，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示與未處理的對照物相比黑色素的含量顯著下降。顯微照片與數(shù)據(jù)結(jié)果相近，驗證了黑色素合成分析中的數(shù)據(jù)，并且膚色的變淺甚至可以肉眼觀察(圖5)。
　　
　　體內(nèi)實驗：色素沉積實驗
　　方法
　　為了進一步證實百脈根共生體提取物作能夠改善膚色，進行了10天