大豆異黃酮對(duì)I 型糖尿病甲基乙二醛水平及白內(nèi)障并發(fā)癥的影響*

盧美萍， SONG Xiu－yuan， MENG Qing－h(huán)e

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州310003;2 Department of Pathology and Laboratory Medicine，College of Medicine，University of Saskatchewan，103 Hospital Drive，Saskatoon，SK，S7N 0W8，Canada)

I 型糖尿病是嚴(yán)重危害人類身心健康的常見慢性病之一。氧化應(yīng)激及過(guò)氧化損傷是糖尿病及其并發(fā)癥的始動(dòng)因素之一。甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)為人體內(nèi)糖代謝產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物，是較強(qiáng)活性的氧自由基之一，參與疾病的氧化損傷作用。近年來(lái)研究表明MG 與糖尿病及其慢性并發(fā)癥密切相關(guān)，有可能是糖尿病并發(fā)癥治療的新靶點(diǎn)［1，2］。大豆異黃酮(isoflavone)是從大豆中分離提取出來(lái)并具有多種生物學(xué)功能的天然生物活性物質(zhì)，具有抗氧化作用，可降低糖尿病病人的血糖、血脂水平，對(duì)糖尿病具有治療作用［3，4］，但確切機(jī)制尚未完全明了。本研究將通過(guò)建立I 型糖尿病大鼠模型，以含不同劑量大豆異黃酮的飼料喂養(yǎng)，以探討大豆異黃酮對(duì)血清MG 水平及糖尿病性白內(nèi)障并發(fā)癥的影響，旨在為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD 大鼠，體重200－250 g，年齡6 周，購(gòu)自加拿大魁北克省(Charles River，Constant，Quebec，Canada)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循薩斯喀徹溫大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)原則。參照文獻(xiàn)［5］制備I 型糖尿病大鼠模型，先將鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma Chemical Co.)溶解在0.01 mol/L 的檸檬酸鈉溶液(pH 4.5)制成STZ 檸檬酸鈉溶液以備用。用血糖自動(dòng)分析儀(Glucometer Elite XL)在STZ 注射前先測(cè)定大鼠空腹基礎(chǔ)血糖值，分別在實(shí)驗(yàn)第1、3、5 d 按100 mg/kg STZ 檸檬酸鈉溶液經(jīng)腹腔注射入大鼠，第7 d 再次測(cè)定空腹血糖值，大鼠血糖>16 mmol/L 確定為糖尿病用于本實(shí)驗(yàn)。

2 大鼠喂養(yǎng)及大豆異黃酮的干預(yù)

糖尿病大鼠模型建立后，隨機(jī)分為3 組(n =9)，分別接受不同劑量大豆異黃酮的特殊大鼠飼料喂養(yǎng):高劑量組(high dose of isoflavone soy protein + diabetes，diabetes+HIS)，低劑量組(low dose of isoflavone soy protein + diabetes，diabetes+LIS)及不含大豆異黃酮的飼料喂養(yǎng)組(diabetes)，3 組大鼠之間比較，其體重、基礎(chǔ)血糖值及STZ 注射后第7 d 空腹血糖值均無(wú)顯著差異。3 種大鼠飼料除大豆異黃酮來(lái)源的蛋白質(zhì)含量不同外，其余的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素的百分比均完全一致［6］，具體的飼料成分見表1。治療后每周監(jiān)測(cè)空腹血糖1次。治療8 周后，饑餓24 h，苯巴比妥鈉240 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉處死大鼠，腹主動(dòng)脈穿刺收集動(dòng)脈血，離心吸取血清，分裝，－80 ℃保存用于檢測(cè)。

表1 含不同劑量大豆異黃酮的大鼠飼料成分Table 1. Ingredients of experimental diets(g/kg)

3 生化及ELISA 法檢測(cè)

生化儀器Synchron LX20 (Beckman)測(cè)定血糖、離子交換HPLC (Bio－Rad Variant II)法測(cè)定血清糖化血紅蛋白水平，根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法檢測(cè)血清還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平。用ELISA 法參照操作說(shuō)明檢測(cè)血清胰島素水平。

4 HPLC 法測(cè)定血清甲基乙二醛水平

25 μL 血清冰上用1/4 體積的高氯酸(perchloric acid，PCA)孵化10 min，12 000 ×g 離心15 min，棄去PCA 沉淀物，上清液加上100 mmol/L 鄰苯二胺，室溫孵化3 h。HPL 通過(guò)Nova－Pak? C18 柱(3.9 mm×150 mm，和4 μm 微粒直徑)測(cè)定甲基乙二醛的喹喔啉衍生物(2－甲基喹喔啉)和5－2－甲基喹喔啉水平。

5 免疫組化法測(cè)定胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平

大鼠處死后取部分胰腺組織，用4%甲醛固定12 h，石蠟包埋，切片用于免疫組化染色。DakoCytomation 試劑盒(Dako，Mississauga，ON，Canada)用于檢測(cè)胰島β－cells 中胰島素表達(dá)情況。操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書。簡(jiǎn)述如下:切片經(jīng)1/500 稀釋的豬抗多克隆抗體(Cat. No. A0064，Dako，Mississauga，ON，Canada)孵化，加入兔抗豬生物素免疫球蛋白Ⅱ抗結(jié)合并洗滌，Ultraview DAD 檢測(cè)試劑盒顯影(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，蘇木素用于染色并計(jì)數(shù)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大豆異黃酮對(duì)血糖、血清糖化血紅蛋白水平的影響

與diabetes+LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血糖明顯降低［(19.50 ±1.85)mol/L vs(28.24 ±3.56)mol/L or (26.94 ±1.82)mmol/L，均P<0.05］，血清糖化血紅蛋白明顯下降［(13.14 ±3.00)% vs (17.16 ±2.60)% or (17.29 ±4.12)%，均P <0.05］。Diabetes +LIS 與模型組比較，血糖、血清糖化血紅蛋白水平均無(wú)顯著差異，見表2。

表2 大豆異黃酮對(duì)血糖、血清糖化血紅蛋白和胰島素水平的影響Table 2. Effects of soy isoflavones on serum levels of glucose，HbA1c or insulin in diabetic rats(±s)

表2 大豆異黃酮對(duì)血糖、血清糖化血紅蛋白和胰島素水平的影響Table 2. Effects of soy isoflavones on serum levels of glucose，HbA1c or insulin in diabetic rats(±s)

* P<0.05，**P<0.01 vs diabetes;#P<0.05，##P<0.01 vs diabetes+LIS.

Group n Glucose(mmol/L)HbA1c(%)Insulin(μg/L)Diabetes 7 26.94±1.82 17.16±2.60 0.39±0.04 Diabetes+LIS 7 28.24±3.56 17.29±4.12 0.55± 0.04 Diabetes+HIS 9 19.50±1.85* # 13.14±3.00* # 2.46±0.35**##

2 血清胰島素及胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平改變

與diabetes +LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血清胰島素水平明顯升高［(2.46 ±0.35)μg/L vs (0.55 ±0.04)μg/L or (0.39 ±0.04)μg/L，均P <0.01］，見表2，diabetes +HIS 組大鼠胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平也明顯增加，見圖1;diabetes+LIS 與模型組比較，血清胰島素及胰島β細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平均無(wú)顯著差異。

Figure 1. Histology of pancreas and insulin immunohistostaining (×200).A:STZ－induced diabetes;B:diabetic rats were treated with LIS protein (diabetes+ LIS);C:diabetic rats were treated with HIS protein(diabetes+HIS). Significantly increased insulin production was observed in rats of diabetes+HIS group compared to the diabetes group (A)or diabetes+LIS group(B).圖1 免疫組化顯示胰腺組織及胰島素表達(dá)情況

3 血清MG 和GSH 水平的變化

與diabetes+LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血清MG 水平明顯降低［(0.77 ±0.09)nmol/L vs (1.57 ±0.17)nmol/L or (1.91 ±0.28)nmol/L，均P <0.05］，而血清GSH 水平明顯增加［(13.26 ±1.61)mmol/L vs (7.35 ±1.55)mmol/L or(5.54 ±1.10)mmol/L，均P <0.01］。Diabetes +LIS 與模型組比較，血清MG 和GSH 水平無(wú)顯著差異，見表3。

表3 大豆異黃酮對(duì)血清MG 和GSH 水平的影響Table 3. Effects of soy isoflavones on serum levels of MG or GSH in diabetic rats(±s)

表3 大豆異黃酮對(duì)血清MG 和GSH 水平的影響Table 3. Effects of soy isoflavones on serum levels of MG or GSH in diabetic rats(±s)

* P<0.05，**P<0.01 vs diabetes;#P<0.05，##P<0.01 vs diabetes+LIS.

Group n MG(nmol/L) GSH (mmol/ L)Diabetes 7 1.91 ±0.28 5.54 ±1.10 Diabetes+LIS 7 1.57 ±0.17 7.35 ±1.55 Diabetes+HIS 9 0.77 ±0.09* # 13.26 ±1.61**

4 各組大鼠死亡情況及白內(nèi)障的發(fā)生情況

在實(shí)驗(yàn)中，diabetes + HIS 組所有大鼠均存活，而模型組和diabetes+LIS 組分別在第5 周和第6 周出現(xiàn)死亡大鼠，至第8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，死亡率均為22%，見表4。白內(nèi)障經(jīng)裂隙燈檢查確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［8］。對(duì)照組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生率在第4 周為11%，第8 周達(dá)86%。Diabetes+LIS 組和diabetes+HIS 組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生分別開始于第6 周和第7 周，發(fā)生率分別為29%和22%，第8 周diabetes +LIS 組上升至43%。Diabetes+HIS 組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生率明顯低于對(duì)照組，見表5。

表4 大豆異黃酮對(duì)糖尿病大鼠死亡的影響Table 4. Effects of isoflavones on the death rate in STZ－induced diabetic rats(%. n=9)

表5 大豆異黃酮對(duì)糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生率的影響Table 5. Effects of isoflavones on incidence of cataract in STZ－induced diabetic rats(%)

討 論

胰島β 細(xì)胞破壞、胰島素分泌不足是I 型糖尿病發(fā)生的主要原因。糖化血紅蛋白是糖尿病控制的良好指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，高劑量大豆異黃酮治療可增加糖尿病大鼠胰島β 細(xì)胞胰島素表達(dá)，提高血清胰島素和GSH 水平，降低糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋水平，減少M(fèi)G 產(chǎn)生，而且，高劑量大豆異黃酮治療還可減少糖尿病大鼠白內(nèi)障并發(fā)癥的發(fā)生。

大豆異黃酮是一類從大豆中分離提取出來(lái)并具有雌性激素樣作用的天然生物活性物質(zhì)，共包括12種化合物，約占全大豆的0.2%－0.4%。其具有降低總膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、提高機(jī)體免疫力、抗菌消炎、抗衰老、抗溶血等多種特殊生理功能;大豆異黃酮獨(dú)特的保健功能及防治多種疾病的作用已受到世人的普遍關(guān)注。近年來(lái)的研究表明，大豆異黃酮可通過(guò)改善抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化機(jī)制，發(fā)揮對(duì)糖尿病的降血糖、降血脂等治療作用［3，4，9，10］。本研究也顯示大豆異黃酮可降低糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋水平，而血清胰島素水平及胰島β 細(xì)胞胰島素表達(dá)水平明顯上升，表明其降血糖作用還可能與大豆異黃酮促進(jìn)胰島β 細(xì)胞功能恢復(fù)、使血清胰島素水平上升有關(guān)，以往研究也顯示大豆異黃酮可通過(guò)抑制胰島細(xì)胞凋亡、提高免疫功能等途徑促進(jìn)胰島β 細(xì)胞功能恢復(fù)［11］。但是，關(guān)于大豆異黃酮對(duì)糖尿病體內(nèi)MG 水平的影響及對(duì)糖尿病性白內(nèi)障的預(yù)防作用，在國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。

MG 作為非酶糖化反應(yīng)中間體，是人體內(nèi)糖代謝產(chǎn)生的一種毒性副產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的氧自由基活性作用。氧化應(yīng)激、過(guò)氧化損傷是糖尿病并發(fā)癥的始動(dòng)因素［1，2］。MG 在糖尿病患者血循環(huán)中大量積累，與氨基酸殘基發(fā)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和交聯(lián)，使各種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化，許多長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)如膠原蛋白隨著糖化時(shí)間延長(zhǎng)而不斷糖化，形成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)堆積，而AGEs 形成過(guò)程中又不斷產(chǎn)生氧自由基。氧自由基過(guò)量產(chǎn)生則抑制GAPDH 活性、使3－磷酸甘油醛增加，并分解產(chǎn)生AGEs 前體分子MG，如此形成氧化應(yīng)激、過(guò)氧化損傷的惡性循環(huán)。近年來(lái)關(guān)于MG 與糖尿病關(guān)系的研究越來(lái)越多。長(zhǎng)期MG 高濃度可促進(jìn)糖尿病患者并發(fā)眼病、腎病、心血管疾病、神經(jīng)性病變，白內(nèi)障和老化等多種糖尿病并發(fā)癥，其機(jī)制可能與MG 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，近年來(lái)不少學(xué)者認(rèn)為MG 是糖尿病并發(fā)癥治療的新靶點(diǎn)［2，12，13］。本研究結(jié)果顯示，大豆異黃酮可減少糖尿病大鼠糖代謝產(chǎn)物MG 形成，機(jī)制可能與大豆異黃酮治療后大鼠體內(nèi)血糖水平下降有關(guān)，體內(nèi)血糖濃度下降可減少糖代謝產(chǎn)物MG 形成;同時(shí)，MG 下降還與大豆異黃酮治療后大鼠體內(nèi)GSH 產(chǎn)生增多有關(guān):GSH 作為抗氧化劑可減少M(fèi)G 形成，GSH還可能與體內(nèi)MG 結(jié)合，增加MG 的清除。

糖尿病高血糖可累及人體多臟器和多系統(tǒng)，引起心、腎、腦、眼、周圍血管、神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥［14，15］，其并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病致殘率和病死率升高的主要原因。在眼部，糖尿病性白內(nèi)障與糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的常見并發(fā)癥，而糖尿病性白內(nèi)障是首要的致盲因素。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制主要:(1)糖代謝異常通路(醛糖還原酶)學(xué)說(shuō);(2)氧化應(yīng)激(非酶性糖基化反應(yīng))學(xué)說(shuō)。在糖尿病患者的高血糖環(huán)境下，MG 濃度增加。生物體內(nèi)的高M(jìn)G 濃度可引發(fā)蛋白質(zhì)和核酸修飾以及細(xì)胞毒性。MG 通過(guò)修飾眼晶體的分子伴侶蛋白導(dǎo)致眼晶體的透性降低甚至喪失，從而引起白內(nèi)障等眼病發(fā)生［2，12，13，16］。因此，早期阻斷MG 生成或者促進(jìn)其代謝是治療糖尿病并發(fā)癥的重要策略之一。我們研究顯示，大豆異黃酮可減少糖尿病大鼠MG 形成，減少糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生率。

綜上所述，大豆異黃酮對(duì)STZ 誘導(dǎo)的I 型糖尿病大鼠不但有降血糖作用，還可減少糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生，機(jī)制可能與大豆異黃酮減少M(fèi)G 產(chǎn)生、增加GSH 形成及抗氧化作用有關(guān)。因此，本研究為大豆異黃酮治療糖尿病及預(yù)防糖尿病并發(fā)癥如糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生提供了依據(jù)。

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