高效液相色譜法測(cè)定奧沙利鉑注射液中奧沙利鉑的含量和有關(guān)物質(zhì)

閆占寬, 李語(yǔ)如, 宋曉光, 梁喜珍

(1.江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,江蘇連云港 222002;2.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院,江西撫州 344000)

高效液相色譜法測(cè)定奧沙利鉑注射液中奧沙利鉑的含量和有關(guān)物質(zhì)

閆占寬1, 李語(yǔ)如1, 宋曉光1, 梁喜珍2

(1.江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,江蘇連云港 222002;2.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院,江西撫州 344000)

建立以高效液相色譜法測(cè)定奧沙利鉑注射液中的奧沙利鉑有關(guān)物質(zhì)和含量的方法,以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,規(guī)格 250 mm×4.6 mm,粒徑 5μm,以水-甲醇(90∶10)為流動(dòng)相,流動(dòng)相用 0.45μm的膜過(guò)濾,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。奧沙利鉑在50～1 600μg/ml的濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度呈線性關(guān)系,線性曲線方程為 A=3 650.9C+17.095(r=0.9999),最低檢測(cè)限為 1.2 ng。加樣平均回收率為 99.4%(RSD=0.81%,n=9)。本方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確,可用于奧沙利鉑注射液中的有關(guān)物質(zhì)和含量的控制。

高效液相色譜法;奧沙利鉑;有關(guān)物質(zhì);含量測(cè)定

奧沙利鉑是繼順鉑和卡鉑之后,由瑞士Debiopharm公司研制開(kāi)發(fā)的第三代鉑類抗癌藥?；瘜W(xué)名為左旋反式二氨環(huán)已烷草酸鉑,它與順鉑的抗腫瘤譜不完全相同,體外和體內(nèi)的臨床研究表明,奧沙利鉑在 15min內(nèi)可完成全部與 DNA結(jié)合,無(wú)蓄積毒性,對(duì)腎臟無(wú)損害,腸癌的細(xì)胞株和耐順鉑的細(xì)胞株等多種腫瘤,有顯著的抑制作用。奧沙利鉑屬于新的鉑類藥物(劉小平等,2007),在水中微溶,在甲醇中極微溶,在乙醇中幾乎不溶;可用液相色譜對(duì)奧沙利鉑的有關(guān)物質(zhì) (郭德嵩等,1999;靖士俠等,2002;姚智東等,2003;任鵬等,2005)、含量進(jìn)行測(cè)定。本文建立了高效液相色譜法測(cè)定奧沙利鉑注射液中的有關(guān)物質(zhì)和奧沙利鉑的含量,該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 儀器和試藥

儀器。Agilent 1100 Pump系統(tǒng),DAD檢測(cè)器,Agilent ChemStation色譜工作站 (安捷倫科技有限公司),電子天平(BP110S,賽多利斯)。

試劑。甲醇 (色譜純,江蘇漢邦科技有限公司),30%過(guò)氧化氫 (分析純,上海桃浦化工廠);鹽酸(分析純,溧陽(yáng)市東方化學(xué)試劑廠);氫氧化鈉(分析純,上海市化學(xué)試劑有限公司);亞硫酸氫鈉(分析純,宜興市亞盛化工廠);純化水 (江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司自制);奧沙利鉑對(duì)照品(歐洲標(biāo)準(zhǔn)品,批號(hào):LOT n02);奧沙利鉑注射液 (批號(hào):05082247,05122347,06020647江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用反相色譜法,用碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,水-甲醇 (90∶10)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。奧沙利鉑與其中的有關(guān)物質(zhì)分離良好,主峰保留時(shí)間合適,峰形對(duì)稱,可用來(lái)測(cè)定奧沙利鉑注射液中的有關(guān)物質(zhì)和含量 (國(guó)家藥典委員會(huì),2004)。

2.2 輔料的干擾試驗(yàn)

在上述色譜條件下,按制劑處方制成輔料溶液,進(jìn)樣分析,色譜圖見(jiàn)圖 1,輔料溶液在 2.4 min左右產(chǎn)生一個(gè)溶劑峰,但不影響有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

2.3 破壞性實(shí)驗(yàn)

取奧沙利鉑注射液適量,按下表方法進(jìn)行光照、酸、堿、加熱、氧化、還原破壞性實(shí)驗(yàn),用上述色譜系統(tǒng)檢查降解產(chǎn)物,色譜圖見(jiàn)圖 2,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法

取奧沙利鉑注射液適量作為供試品溶液,取供試品溶液適量,用水稀釋制成每 1 ml中含 20μg的溶液作為對(duì)照溶液。量取對(duì)照液 10μl,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)儀器檢測(cè)靈敏度,使主成份色譜峰高約為滿量程的 20%。量取供試品溶液 10μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的 2.5倍,量取峰面積,按面積歸一化法和自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2。

表1 奧沙利鉑注射液的降解情況表Tab.1 Degradation information card of oxaliplatin injection

表2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Related substance determ in consequence

面積歸一化法和自身對(duì)照法分別計(jì)算奧沙利鉑注射液的有關(guān)物質(zhì),測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,水-甲醇 (90∶10)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm,理論板數(shù)按奧沙利鉑計(jì)算不低于 2 000。

2.5.2 線性曲線的測(cè)定

取奧沙利鉑對(duì)照品適量,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻。取此溶液適量,用水稀釋成濃度分別為1.6,0.8,0.4,0.2,0.1,0.05 mg/ml的溶液,分別精密量取上述溶液各 20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積。以峰面積 (A)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣濃度(C)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,線性曲線為A=3650.9C+17.095,r=0.999 9。

圖3 奧沙利鉑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The oxaliplatin standard curve

2.5.3 檢測(cè)限和定量限的確定

在本實(shí)驗(yàn)條件下,取線性曲線下 0.05 mg/ml的溶液適量,稀釋至濃度為 0.2μg/ml的溶液,進(jìn)樣 20μl,以信噪比 S/N=10計(jì)算,奧沙利鉑的定量限為 4 ng;將定量限下溶液稀釋至濃度為 0.06μg/ml的溶液,進(jìn)樣 20μl,以信噪比 S/N=3計(jì)算,奧沙利鉑的檢測(cè)限為 1.2 ng。

2.5.4 含量測(cè)定的精密度和溶液的穩(wěn)定性

(1)含量測(cè)定的精密度。移取奧沙利鉑注射液適量,用水稀釋制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作為供試品溶液;另取奧沙利鉑對(duì)照品適量,精密稱定,用水溶解制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量及計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,考察該測(cè)定含量方法的精密度。含量測(cè)定的精密度試驗(yàn) RSD%=1.8(n=6),含量平均值為 100.3%,表明該方法的精密度好。

(2)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)。取精密度測(cè)定項(xiàng)下的溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),分別測(cè)定溶液放置 1,4,8 h后的含量。結(jié)果表明,奧沙利鉑注射液溶液穩(wěn)定性的RSD%=0.17(n=4),表明溶液在 8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

按10瓶處方量,精密稱取相當(dāng)于 80%,100%,120%主藥量的主藥和空白輔料液,混合均勻后作為回收率樣品。分別精密稱取回收率樣品適量,加水溶解并稀釋成每 1 ml中約含 0.4 mg的溶液作為供試品溶液;另取奧沙利鉑對(duì)照品適量,精密稱定,用水溶解制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算樣品的回收率,平均回收率為99.4%,RSD%=0.81(n=9)。

2.5.6 含量測(cè)定方法

精密移取奧沙利鉑注射液適量,用水制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作為供試品溶液;另取奧沙利鉑對(duì)照品適量,精密稱定,用水溶解制成每 1 ml中含0.4 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量。三批樣品 05082247,05122347,06020647的含量測(cè)定結(jié)果分別為:98.2%,100.4%,99.8%。

3 討論

對(duì)采用不同組成和比例的流動(dòng)相的分離結(jié)果進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,以甲醇 -水(10∶90)為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好。在本色譜條件下,能夠很好地檢測(cè)出有關(guān)物質(zhì)及降解產(chǎn)物。因此,采用本色譜條件來(lái)測(cè)定奧沙利鉑注射液中奧沙利鉑的含量和有關(guān)物質(zhì),該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

郭德嵩,陳世銘.1999.第三代鉑類抗癌藥物奧沙利鉑的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè),10(1):4-8.

國(guó)家藥典委員會(huì).2004.國(guó)家新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第 35冊(cè)[S].171-172.

靖士俠,柳月安.2002.奧沙利鉑的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,22(3):171-172.

劉小平,耿丹清,石炳光,等.2007.奧沙利鉑脂質(zhì)體中奧沙利鉑的含量測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),4(25):101-102.

任鵬,孫堅(jiān)彤,沈云玉,等.2005.反相高效液相色譜法測(cè)定奧沙利鉑的含量[J].抗感染藥學(xué),2(1):24.

姚智東,吳洪斌.2003.奧沙利鉑的安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志,12(7):567-569.

Oxaliplatin Determ i nation of Oxaliplatin I njection L iquid by High Performance L iquid Chromatography

YAN Zhan-kuan1, L I Yu-ru1, SONG Xiao-guang1, L I ANG Xi-zhen2
(1.Jiangsu HengruiMedicine Co.,LTD,Lianyungang,JS 222000,China;2.Faculty of ChemistryBiology andMaterial Science,East China Institute of Technology,Fuzhou,JX 344000,China)

To establish the determination method of related substances and content of oxaliplatin injection by high perfor mance liquid chromatography(HPLC).HPLC is performed to determine octadecylsilyl silica gel chromatography column,250 mm ×4.6 mm,diameter 5μm,The mobile phase ismethanol-water(10∶90),mobile phase by 0.45μm membrane filter,the detectingwavelength is 250 nm.The detected concentration of oxaliplatin is in the good linear range of 50～1 600μg/ml(r=1.000 0),the li mitof detection is 1.2 ng,and the average recovery is 99.4%(RSD=0.81%,n=9).The established method is si mple,sensitive,accurate and available for the quality control of oxaliplatin.

high perfor mance liquid chromatography;oxaliplatin;related substances;content assay

R927.2

A

1674-3504(2010)03-290-03

10.3969/j.issn.1674-3504.2010.03.13

2009-08-31

閆占寬 (1975—),男,工程師,主要從事質(zhì)量管理和質(zhì)量控制工作。E-mail:yanzhankuan@163.com