Pannonibacter phragmitetusBB的分離、鑒定及其對Cr(Ⅵ)還原研究

黃順紅

(湖南有色金屬研究院,湖南長沙 410015)

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Pannonibacter phragmitetusBB的分離、鑒定及其對Cr(Ⅵ)還原研究

黃順紅

(湖南有色金屬研究院,湖南長沙 410015)

文章旨在分離獲得高效的Cr(Ⅵ)還原功能菌。結(jié)果表明,從湖南某鉻渣堆場鉻污染土壤中分離出一株具有較強還原Cr(Ⅵ)能力的細菌,24 h內(nèi)基本還原500 mg/L Cr(Ⅵ)。細菌16S rDNA的測序及比對均顯示該菌屬Pannonibacter phragmitetus,并將此細菌命名為BB。掃描電鏡(SEM)表明,P.phragmitetusBB在500 mg/L Cr(Ⅵ)下,其細胞形態(tài)仍然是很完整,沒有破裂和穿孔。EDAX分析表明,Cr是還原產(chǎn)物中的最主要元素。XPS分析進一步表明,Cr(Ⅵ)的還原產(chǎn)物是Cr(Ⅲ)化合物。

Pannonibacter phragmitetus;六價鉻;還原;產(chǎn)物

環(huán)境中的鉻污染主要來自于礦石的冶煉、鐵合金的生產(chǎn)、顏料的制作、皮革加工以及煤和石油的燃燒,不合理的鉻渣堆存方式導(dǎo)致日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。鉻主要以Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)這二種價態(tài)穩(wěn)定存在于環(huán)境中,Cr(Ⅵ)具有極強毒性,有致癌性、致畸性、致突變性[1,2],而Cr(Ⅲ)毒性很小,且在環(huán)境中相對穩(wěn)定。此外,Cr(Ⅵ)可移動,易溶于水,而Cr(Ⅲ)在pH＞5時易形成不溶于水的氧化物和氫氧化物[3]。因而,Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)是一種較好的治理環(huán)境鉻污染的措施。

近幾十年使用的Cr(Ⅵ)化學(xué)還原法,由于其高成本和產(chǎn)生的二次污染問題,被認(rèn)為是一種不理想的Cr(Ⅵ)污染治理手段[4]。近來,由于生物處理法具有經(jīng)濟性、安全性及穩(wěn)定性,越來越多的學(xué)者致力于Cr(Ⅵ)污染的生物修復(fù)研究。許多不同種類的土著微生物從活性污泥和工業(yè)廢水中分離出來,并有效地把有毒的、易溶的 Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為低毒的 Cr (Ⅲ)[5,6]。然而,由于取樣的艱巨,從鉻渣堆下土壤中分離出來的鉻還原菌未見報道。

Pannonibacter phragmitetusBB是一種新的高效六價鉻還原菌,分離自高堿、高鉻的鉻渣堆放場土壤。在此,作者研究該菌在純培養(yǎng)液中對Cr(Ⅵ)的還原,觀察Cr(Ⅵ)還原前后該菌的形態(tài)變化,并利用X射線能譜(EDAX)和X射線光電子能譜(XPS)分析確定還原產(chǎn)物的成分。

1 實驗方法與材料

1.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基按以下組分配制:蛋白胨10 g,NaCl 2 g,酵母浸膏5 g,葡萄糖4 g,H2O 1 L,調(diào)節(jié)pH值至9.8。

配制好的培養(yǎng)基于121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min后,冷卻備用。

1.2 Cr(Ⅵ)還原菌的采集和分離

稱取10 g湖南某廠鉻渣堆場表層土壤于150 mL已滅菌的錐形瓶中,加入10 mL滅菌培養(yǎng)基,于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后,稀釋涂布平板法分離。在250 mg/LCr(Ⅵ)固體培養(yǎng)基上,輕輕轉(zhuǎn)動平板,使菌液與培養(yǎng)基混合均勻,用三角棒充分涂勻,將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,觀察菌落的形態(tài)。用平板劃線分離法,用接種針挑取不同形態(tài)的菌落,接種于含250 mg/LCr(Ⅵ)的固體培養(yǎng)基上,倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間,即可得到鉻耐受菌的純菌株,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上所用介質(zhì)均在高壓滅菌鍋中121℃下滅菌30 min。

1.3 細菌的鑒定

委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對鉻還原菌進行核酸序列的測定。

將所測得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株的16S rDNA序列進行比較,依據(jù)比較結(jié)果選擇相關(guān)菌株的16S rDNA序列,采用Blast方式進行多序列匹配排列,通過 Mega3.1軟件中Neighbor Joining的方法,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 鉻耐受菌還原六價鉻的能力檢測

用接種環(huán)挑取菌株于裝有100 mL滅菌培養(yǎng)基的錐形瓶中,30℃,150 r/min搖床培養(yǎng)24 h后,移取10 mL該菌液,接種到含500 mg/L Cr(Ⅵ)的培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)72 h,期間,分別在培養(yǎng)后6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h取樣,每次所取樣品離心后上清液用于殘余Cr(Ⅵ)的測定。以沒有接種細菌的培養(yǎng)基做空白。所有的實驗三次重復(fù)。

1.5 分析檢測方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法[7]測定溶液中Cr (Ⅵ)濃度。

還原前后細菌形貌用掃描電鏡(SEM,J EOLJSM -6360LV)和透射電鏡(TEM,J EM-1230)分別進行觀察并拍照。

反應(yīng)中生成藍灰色沉淀,在真空抽濾裝置中用去離子水沖洗4遍,除去沉淀中可溶性物質(zhì),于120℃烘干8 h,用X射線能譜儀(EDAX,Finder 1000)分析其元素組成。

取少量上述烘干的沉淀樣品置于X射線光電子能譜儀(J PS-9200)測定反應(yīng)產(chǎn)物中鉻的價態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌的分離與鑒定

從鉻渣堆下土壤中分離到四株鉻耐受菌。從顏色上看,有蘭灰色、淺灰色、白色、黃色四種鉻耐受菌在含250 mg/L Cr(Ⅵ)的培養(yǎng)基中生長,其中一株細菌在250 mg/L Cr(Ⅵ)固體培養(yǎng)基中長成的菌落顯示獨特的蘭灰色,且呈圓形、隆起,表面光滑、濕潤、邊緣整齊。將該細菌命名為BB菌。細菌BB的分子生物學(xué)鑒定表明,其擴增的16S rDNA基因序列長度為1 410 bp。

將細菌BB的16S rDNA序列提交到 Genbank數(shù)據(jù)庫中,用BLAST程序?qū)毦鶥B的16S rDNA基因序列和Genbank中已登錄的16S rDNA基因序列進行核苷酸同源性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細菌BB的16S r DNA與菌株P(guān)annonibacter phragmitetusstrain有很高的同源性,其相似性達到99%(如圖1所示)。因此,初步鑒定該細菌BB應(yīng)歸屬于Pannonibacter phragmitetus。

圖1 基于BB菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

從不同污染場地分離出的鉻還原菌種類很多,主要有脫硫弧菌(Desulf ovibrio vulgaris)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、希瓦氏菌(Shewanella sp.)等。但迄今為止,還沒有Pannonibacter phragmitetus strain還原Cr(Ⅵ)的報道。本研究所發(fā)現(xiàn)的細菌可為微生物修復(fù)Cr(Ⅵ)污染提供一種新的微生物源。

2.2 P.phragmitetusBB還原Cr(Ⅵ)

挑取P.phragmitetusBB單菌落,接種到100 mL滅菌無鉻液體培養(yǎng)基中,于30℃振蕩箱中培養(yǎng)24 h后,按10%接種量分別移取相應(yīng)體積的菌液于含Cr(Ⅵ)濃度500 mg/L的培養(yǎng)基中,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于培養(yǎng)后一定時間,取一定量培養(yǎng)液,離心,測定上清液Cr(Ⅵ)濃度,結(jié)果如圖2所示,由圖2可知,在有菌液的培養(yǎng)液中,24h內(nèi)Cr(Ⅵ)基本去除,而在未接種細菌的培養(yǎng)液中,Cr(Ⅵ)濃度基本未變,這說明P.phragmitetusBB有較強的還原Cr(Ⅵ)的能力。在P.phragmitetusBB還原Cr(Ⅵ)過程中,有明顯的顏色變化,含Cr(Ⅵ)的培養(yǎng)液從最初的黃色變成蘭灰色,而且,有大量蘭灰色沉淀物聚積在瓶底,這種沉淀物可能是Cr(Ⅲ)化合物。

圖2 Cr(Ⅵ)隨培養(yǎng)時間遞增的濃度變化

2.3 鉻還原菌BB還原Cr(Ⅵ)前后的形貌特征

為進一步了解P.phragmitetusBB還原Cr(Ⅵ)前后自身形貌的變化,將上述含500 mg/L Cr(Ⅵ)和不含鉻的細菌BB培養(yǎng)液在4℃,10 000 r/min離心,收集菌體并烘干,固定,噴金,于掃描電鏡(SEM)下觀察,掃描電鏡圖如圖3所示。由圖3(A)和(B)可知,無鉻培養(yǎng)基中生長的細菌BB表面是完整的,P.phragmitetusBB呈桿狀,尾部生有鞭毛,表面附有少量絲狀物質(zhì)。在500 mg/L Cr(Ⅵ)培養(yǎng)基中生長的細菌(圖3(C)和(D)),其細胞形態(tài)仍然是很完整,沒有破裂和穿孔,說明該Cr(Ⅵ)濃度不會對細菌BB造成毒害,P.phragmitetusBB可以耐受 500 mg/L Cr(Ⅵ)甚至更高濃度的Cr(Ⅵ)。

P.phragmitetusBB還原500 mg/L Cr(Ⅵ)后另一個形貌變化就是還原后的細菌介質(zhì)中有大量的不定形物質(zhì)生成(圖3(C)和(D)),同時,一些細菌的末端黏附著一團不定形物質(zhì),該物質(zhì)在無鉻培養(yǎng)的細胞上是不存在的,因此初步推測,該物質(zhì)為Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物——三價鉻的沉淀。研究發(fā)現(xiàn),Cr(Ⅵ)還原后的產(chǎn)物,常常以不同的形式附著在鉻還原菌的表面[8～10]。Shewanella oneidensisMR-1還原 Cr (Ⅵ)的產(chǎn)物Cr(Ⅲ),與細菌DNA纏繞在一起,以小圓球的形式積聚在細胞表面[1]。而對于A rthrobacterK-4,鉻還原的產(chǎn)物以不規(guī)則的小結(jié)形態(tài)束縛于細菌表面[7]。

圖3 無鉻培養(yǎng)的 P.phragmitetusBB掃描電鏡圖(SEM)和500 mg/L Cr(Ⅵ)生長中的 P.phragmitetusBB掃描電鏡圖

P.phragmitetusBB透射電鏡圖如圖 4所示。在放大倍數(shù)為20 000的透射電鏡下發(fā)現(xiàn),反應(yīng)前細菌表面無附著物,內(nèi)部有空腔或者囊泡結(jié)構(gòu),推測菌體內(nèi)黑點為細菌的遺傳物質(zhì)(圖4(A))。還原后細胞的切片截面如圖4(B)所示,可以看到在細胞表面圍繞著一圈深色物質(zhì),該物質(zhì)相對分子質(zhì)量較大,因此,可以判斷該物質(zhì)和掃描電鏡照片中細胞末端無定形物質(zhì)一樣,為還原反應(yīng)的產(chǎn)物。

圖4 P.phragmitetusBB透射電鏡圖(TEM)

2.4 還原產(chǎn)物的EDAX分析

將P.phragmitetusBB還原500 mg/L Cr(Ⅵ)后的培養(yǎng)液離心,下部沉淀用去離子水清洗兩次,離心,烘干,進行EDAX元素分析,結(jié)果如圖5所示。根據(jù) EDAX譜線圖,P.phragmitetusBB還原 Cr (Ⅵ)的產(chǎn)物中,基本元素有Cr、C、O、N、P、K、Na、Mg、Ca、S、Al及Si。除了元素O、C和N峰外,元素Cr峰高于其它元素峰。在收集Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物時,離心的沉淀部分含有大量P.phragmitetusBB細胞,而菌體元素主要是由C、H、O、N所組成。因此,從EDAX元素分析,反映出C、O、N含量高于Cr。除了這三種元素,Cr是產(chǎn)物中最主要元素。

圖5 還原產(chǎn)物的x射線能譜

2.5 還原產(chǎn)物的XPS分析

將P.phragmitetusBB還原500 mg/L Cr(Ⅵ)的產(chǎn)物,烘干,磨細,進行 X射線光電子能譜分析(XPS),分析結(jié)果如圖6所示。細菌BB還原六價鉻產(chǎn)物的XPS全元素掃描結(jié)果如圖6(A)所示,從圖6 (A)中可以看出,產(chǎn)物中含有的主要元素為Cr、C、O及N。圖6(B)為Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物中鉻元素Cr2p3/2和Cr2p1/2峰的XPS窄幅掃描譜,構(gòu)成Cr2p3/2峰和2p1/2峰的中心位置分別位于577.1±0.1和586.9±0.1 eV。文獻[12]表明,氫氧化鉻中Cr-O鍵的Cr2p3/2峰的峰值在576.5～576.9 eV之間,三價鉻的主要分裂線Cr2p3/2和Cr2p1/2峰位相差9.9 eV左右,而Cr(Ⅵ)的Cr2p3/2峰位在579.0～579.8 eV之間,主要分裂線Cr2p3/2和Cr2p1/2峰位相差 8.7～9.4 eV。文獻[13]及[14]表明, Cr(OH)3·0.4H2O中 Cr(OH)3中 Cr-O鍵的Cr2p3/2峰位為577.0 eV及577.1 eV,在這幾種化合物中,Cr是以三價存在的,細菌BB還原Cr(Ⅵ)產(chǎn)物中鉻的Cr2p3/2峰位也在這個位置,說明Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物中有Cr(Ⅲ)存在。圖6(C)表明了Cr(Ⅵ)還原后的產(chǎn)物中氧元素的O1s譜線,從圖可以看出,其峰位在531.4±0.1 eV。另外,文獻[15]報道,當(dāng)金屬與氫氧化物結(jié)合時(M-OH),其中的Cr-O鍵的O1s峰位為531.4 eV,這與Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物中氧的峰位完全重合。這表明,P.phragmitetusBB還原Cr(Ⅵ)產(chǎn)物中的Cr(Ⅲ)是以Cr(OH)3作為Cr的結(jié)合狀態(tài)。此外,化合物 K2Cr2O7中Cr(Ⅵ)的Cr2p3/2結(jié)合能在579.4±0.2～579.8 eV之間[16],而從圖6所顯示的細菌BB還原六價鉻產(chǎn)物中Cr2p3/2在這一位置上并沒有譜峰出現(xiàn),這說明Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物中沒有Cr(Ⅵ)存在,這進一步說明了P.phragmitetusBB能徹底還原500 mg/L Cr(Ⅵ)。

3 結(jié) 論

1.從鉻渣堆場鉻污染土壤中分離到的細菌BB,能在24 h內(nèi)能基本還原500 mg/L Cr(Ⅵ),16S rDNA的測序及比對均顯示鉻還原菌BB是Pannonibacterphragmitetus的一種。

2.P.phragmitetusBB可以耐受500 mg/L Cr (Ⅵ)甚至更高濃度的Cr(Ⅵ)。

3.P.phragmitetusBB還原Cr(Ⅵ)是在胞外發(fā)生。Cr(Ⅵ)還原后的產(chǎn)物是Cr(OH)3。

圖6 細菌BB還原Cr(Ⅵ)產(chǎn)物的X射線光電子能譜(XPS)

[1] Cheung KH,Gu JD.Mechanism of hexavalent chromium detoxification by microorganisms and bioremediation application potential: A review[J].International Biodeterioration &Biodegradation, 2007,59(1):8-15.

[2] Messer J,Reynolds M,Stoddard L,et al.Causes of DNA singlestrand breaks during reduction of chromate by glutathione in vitro and in cells[J].Free Radical Biology and Medicine,2006,40(11): 1981-1992.

[3] Rai D,Sass B.M,Moore D.A.Chromium(II1)hydrolysis constants and solubility of Chromium(II1) hydroxide[J]. Inorg.Chem.1987,26:345-349.

[4] Fulladosa E,Desjardin V,Murat J.C,et al.Cr(Ⅵ)reduction into Cr(Ⅲ)as a mechanism to explain the low sensitivity of Vibrio fischeri bioassay to detect chromium pollution[J].Chemosphere, 2006,65(4):644-650.

[5] Srivastava S,Thakur I.S.Evaluation of bioremediation and detoxification potentiality of Aspergillus niger for removal of hexavalent chromium in soil microcosm[J].Soil.Biol.Biochem.2006,38(7): 1 904-1 911.

[6] Guha H,Jayachandran K,Maurrasse F.Microbiological reduction of chromium(Ⅵ)in presence of pyrolusite-coated sand by Shewanella alga Simidu ATCC55627 in laboratory column experiments [J].Chemosphere,2003,52(1),175-183.

[7] 魏復(fù)盛.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,1989.159.

[8] Lin Z,Zhu Y,Kalabegishvili TL,et al.Effect of chromate action on morphology of basalt-inhabiting bacteria[J].Materials Science& Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems,2006,26 (4):610-612.

[9] Zhu WJ,Yang ZH,Ma ZM,et al.Reduction of high concentrations of chromate by Leucobacter sp CRB1 isolated from Changsha,China[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2008,24 (7):991-996.

[10]Zakaria ZA,Zakaria Z,Surif S,et al.Hexavalent chromium reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater[J].Journal of Hazardous Materials,2007, 146(1-2):30-38.

[11]Middleton SS,Latmani RB,Mackey MR et al.Cometabolism of Cr (Ⅵ)by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth[J].Biotechnology and Bioengineering,2003,83(6):627-637.

[12]McCafferty E,Bernett MK,Murday JS.An XPS study of passive film formation on iron in chromate solutions[J].Corrosion Science,1988,28:559-576.

[13]Asami K,Hashimoto K.X-ray photoelectron-spectra of several oxides of iron and chromium[J].Corrosion Science,1977,17:559-570.

[14]Moffat TP,Latanision RM,Ruf RR.An X-ray photoelectron spectroscopy study of chromium-metalloid alloys-Ⅲ[J].Electrochimica Acta,1995,40(11):1 723-1 734.

[15]Jung Y,Choi J,Lee W.Spectroscopic investigation of magnetite surface for the reduction of hexavalent chromium[J].Chemosphere,2007,68(10):1 968-1 975.

[16]Ikemoto I,Ishii K,Kinoshita S,et al.X-ray photoelectron spectroscopic studies of CrO2and some related chromium compounds[J]. Journal of Solid State Chemistry,1976,17(4):425-430.

Study on the Isolation and Identification of Pannonibacter PhragmitetusBBand Its Reducing Cr(Ⅵ)

HUANGShun-hong

(Hunan Research Institute of Nonferrous Metals,Changsha410015,China)

The objective of this study was to find an indigenous Cr(Ⅵ)-reducing bacterium that can effectively be usedfor Cr(Ⅵ)remediation in the contaminated soils.The results showed that one isolate from soil under a chromium-containing slag heap at a steel-alloy factory in Hunan had a strong ability of reducing Cr(Ⅵ).It can completely reduce 500 mg/L Cr(Ⅵ)within 24 h.Based on 16S rDNA gene sequence and similarity analysis,this isolate was identified asPannonibacter phragmitetusand assigned as strain BB.Images of scanning electron microscopy(SEM)indicated that the cell surface ofP.phragmitetusBB remained intact without cell rupture under 500 mg/L Cr(Ⅵ)stress.Elemental analysis by energy dispersive X-ray(EDAX)revealed that Cr was the major element comprising the reduction product.Furthermore,X-ray photoelectron spectroscope(XPS)verified that the Cr(Ⅵ)reduction product was Cr(Ⅲ)compounds.

Pannonibacter phragmitetus;hexavalent chromium;reduction;product

X172

A

1003-5540(2010)06-0052-06

黃順紅(1972-),女,博士,工程師,主要從事重金屬廢水、廢渣處理與資源化、礦冶環(huán)境生物技術(shù)的研究工作。

2010-09-25