時(shí)間分辨在檢測抗-HBs的優(yōu)勢應(yīng)用

婁宏哲

我國現(xiàn)有1.3億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBS)感染者，定量檢測乙型肝炎病毒抗-HBs的滴度可對(duì)接種疫苗的效果進(jìn)行評(píng)估，用于判定是否需要加強(qiáng)免疫，還可以評(píng)估普通人群免疫力。目前國內(nèi)抗定量分析有各種化學(xué)發(fā)光法和放射免疫分析，這些方法因儀器試劑昂貴或者需要使用放射元性素而無法普及應(yīng)用，時(shí)間分辨熒光免疫分析采用非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，能定量檢測乙型肝炎病毒標(biāo)志物，是特異性及靈敏度均較高的一種新的檢測方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 檢測226例標(biāo)本，為某單位職工注射疫苗1年后體檢抽取?？崭共伸o脈血3 ml置促凝管內(nèi)，3500 r/min離心取血清備用。

1.2 方法與試劑 時(shí)間分辨采用中山達(dá)安基因股份有限公司膠體金方法采用廣州萬孚生物技術(shù)有限公司ELISA方法采用上?？迫A生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理 TRFIA法檢測采用雙抗原夾心分析法。用HBsAg包被反應(yīng)板，加入定標(biāo)品或待測樣品，樣品中的抗-HBs與已包被的HBsAg結(jié)合成抗體-抗原復(fù)合物，再加入銪標(biāo)記的 HBsAg，形成 HBsAg-抗-HBs-HBsAg-DTTA-Eu復(fù)合物。增強(qiáng)液將復(fù)合物上的Eu3+解離到溶液中，并與增強(qiáng)液中的有效成分形成高熒光強(qiáng)度的螯合物，其熒光強(qiáng)度與樣品中的抗-HBs濃度成正比。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本中抗-HBs的濃度。膠體金方法試劑條上以膠體金為標(biāo)記包被重組乙肝表面抗原，應(yīng)用免疫層析原理檢測樣本中的抗-HBs。抗-HBs采用雙抗原夾心法檢測標(biāo)本中抗-HBs。

1.4 儀器 泰萊-Ⅰ型半自動(dòng)時(shí)間分辨分析系統(tǒng)，F(xiàn)WI-ⅠMICRO-DSCILLATOR振蕩器，DEMⅢ型自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，GDVDV990BV4酶標(biāo)儀。

2 操作與結(jié)果

2.1 結(jié)果判定 TRFIA法定量檢測值＞10IU/L，判為陽性。ELISA法定性cut off(CO)為陰性對(duì)照孔OD均值N×2.1，樣品OD值S/CO≥1為抗-HBs陽性。膠體金法在檢測區(qū)(T)及對(duì)照區(qū)(C)各出現(xiàn)一條紅色反應(yīng)線為陽性。

2.2 結(jié)果比照

表1 TREIA法、ELISA法與GICA法檢測結(jié)果比照(例)

時(shí)間分辨的方法和ELISA與膠體金的方法陽性吻合率分別為98.6%和97.7%。

3 討論

目前測定抗-HBs的免疫學(xué)方法主要有ELISA、CLIA、ECLIA、RIA、膠體金免疫層析法(GICA)、斑點(diǎn)金免疫滲透法(DIGFA)、微粒子酶免疫分析(MEIA)、TRFIA 法等［1］。

醫(yī)學(xué)上研究乙肝和乙肝防治，特別是觀察療效，都需要定量的分析手段。時(shí)間分辨熒光分析(TRFIA)是以稀土離子標(biāo)記抗原抗體、核酸探針和細(xì)胞等為特征的超靈敏度檢測技術(shù)，用生物素、酶等大分子標(biāo)記物，須通過一系列化學(xué)反應(yīng)來檢測，其過程受影響因素較多，用原子直接標(biāo)記，避免了各種不利因素的影響。它克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定性、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光及一般熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾的難點(diǎn)，通過時(shí)間延遲和波長分辨，使非特異性信號(hào)降低到可以忽略的程度，達(dá)到了極高的性噪比，從而大大的超過了放射性同位素所能達(dá)到的測定靈敏度。

有資料表明，抗-HBs的含量在10 mIU/ml以上的人群并不代表機(jī)體都一定具有免疫力。抗-HBs含量在10～100 mIU/ml之間的人群對(duì)HBV的免疫力弱，甚至不能預(yù)防HBV感染。只有抗-HBs的含量達(dá)到100 mIU/ml以上時(shí)，才有能力抵抗HBV的入侵;其含量越高，機(jī)體抵抗HBV入侵的能力越強(qiáng)［2］。同時(shí)，分析HBsAg和抗-HBs濃度的變化，可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。若HBsAg濃度降低，抗-HBs濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展。反之，HBsAg濃度處于較高水平或上升趨勢，而抗-HBs一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。德國終身預(yù)防接種委員會(huì)乙肝疫苗復(fù)種方案說明:抗-HBs在10～100 mIU/ml，每3～6個(gè)月復(fù)查1次;抗-HBs＞100 mIU/ml，10年后才需要加強(qiáng)一針;2.1～10.0 mIU/ml認(rèn)為是對(duì)乙肝疫苗接種效果差;0.～2.1 mIU/ml認(rèn)為是對(duì)乙肝疫苗接種無效果。有文獻(xiàn)報(bào)道9次注射乙肝疫苗仍檢測不到抗-HBs。對(duì)此有關(guān)專家曾進(jìn)行不少觀察與研究，除增加接種次數(shù)提高陽性率外，接種劑量對(duì)抗-HBs的產(chǎn)生也呈正相關(guān)，有人用 20 μg ×3，30 μg-30 μg-10 μg，30 μg×3三種方法的免疫效果相同，與10 μg×3相比也有非常顯著性差異，另外也有報(bào)道，改變第二次與第三次注射的間隔時(shí)間可以提高免疫效果［3］。因此為了提高乙肝疫苗的免疫效果呢，除及時(shí)檢測抗-HBs采取補(bǔ)救措施外尚需要根據(jù)其他學(xué)者的改進(jìn)措施進(jìn)一步探索。

在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)操作時(shí)差不可避免的對(duì)結(jié)果有影響，在室溫(18℃ ～25℃)下手工加樣設(shè)備加完一塊板需時(shí)10 min而導(dǎo)致的弱陽性標(biāo)本及高值陰性標(biāo)本的檢測值結(jié)果的差異客觀存在，因此初試中對(duì)于高值陰性標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行雙孔復(fù)試，且復(fù)試時(shí)應(yīng)保證加樣順序的優(yōu)先性。TRF操作過程中還應(yīng)注意TRF抗-HBs的銪標(biāo)志物溶解后，易受環(huán)境中稀土元素污染而出現(xiàn)假陽性，需在1個(gè)月內(nèi)用完，否則測定結(jié)果將會(huì)受影響［4］。

酶聯(lián)免疫法的特點(diǎn)在于它的操作簡便，適用于大批量標(biāo)本的檢測，且成本低廉，其靈敏度也很好，但無法定量，只能滿足臨床對(duì)單純陰、陽性結(jié)果的判定。對(duì)抗-HBs陽性結(jié)果是否具有保護(hù)意義無法提示。而且要注意其一些影響因素，如實(shí)驗(yàn)室恒溫水箱、移液器、酶標(biāo)儀之間的差異及操作人員手法間的區(qū)別等;甚至加完終止液到酶標(biāo)儀讀測的時(shí)間長短也會(huì)造成結(jié)果的不一致。內(nèi)源性物質(zhì)(補(bǔ)體、AFP、RF、自身抗體)的干擾和外源性物質(zhì)(血液抗凝劑)、試劑盒質(zhì)量(特別是抗原包被的質(zhì)量)等均可影響ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確度，對(duì)其檢測的弱陽性標(biāo)本應(yīng)復(fù)查，以減少誤報(bào)。

快速膠體金滲率檢測板檢測乙肝血清標(biāo)志物漏檢的原因:①加樣量的不足或過多，可造成結(jié)果的誤判;②溫度影響:溫度過低，反應(yīng)速度降低，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)弱陽性結(jié)果不能完全顯現(xiàn)出來，造成誤判;③快速膠體金滲率檢測板極易受潮導(dǎo)致結(jié)果誤判;④快速膠體金滲率檢測板檢測時(shí)水平位置的不同，影響血清擴(kuò)散速度而造成結(jié)果誤判［5］。

通過以上分析，時(shí)間免疫分析法是近幾年迅速崛起的新方法，靈敏度高，標(biāo)記物制備簡便，儲(chǔ)存時(shí)間長，無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)，成為繼放射免疫分析之后標(biāo)記物發(fā)展的一個(gè)新的里程碑。

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［3］林青.注射乙肝疫苗后不同階段的表面抗體濃度測定分析.湖南醫(yī)學(xué)，2006，17(2):130-131.

［4］王?？。_佳臻.兩種方法檢測低濃度乙型肝炎病毒表面抗體的探討.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(6):485-487.

［5］李輝，卞文安.快速膠體金滲濾檢測板與ELISA法檢測乙肝血清標(biāo)志物的對(duì)比分析.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，1(29):132-135.