氧化葡萄糖酸桿菌立體選擇催化2-甲基-1，3-丙二醇合成(R)-β-羥基異丁酸*

氧化葡萄糖酸桿菌立體選擇催化2-甲基-1，3-丙二醇合成(R)-β-羥基異丁酸*

魏國棟，魏東芝，林金萍
(華東理工大學(xué)，魯華生物技術(shù)研究所，生物反應(yīng)器國家重點實驗室，上海，200237)

β-羥基異丁酸是一種重要的化工醫(yī)藥產(chǎn)品，主要用于合成降壓藥卡托普利和其它的光學(xué)活性物質(zhì)。試驗利用氧化葡萄糖酸桿菌不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇合成了光學(xué)純的(R)-β-羥基異丁酸，研究表明:在28℃和pH值5.5、底物濃度5 g/L、濕細(xì)胞濃度20 g/L的情況下，經(jīng)過10 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到20.5 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到88.6%和95.3%。在培養(yǎng)基中添加一定量(0.1%)的1，2-丙二醇和乙二醇對菌體生長、立體選擇性和催化活性都有一定的促進(jìn)作用。通過流加2-甲基-1，3-丙二醇使其在反應(yīng)體系中的濃度維持在5 g/L以下，以消除過高的底物濃度對細(xì)胞活性的抑制，在3.7 L反應(yīng)器中經(jīng)過24 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度提高到50.2 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。

氧化葡萄糖酸桿菌，生物轉(zhuǎn)化，2-甲基-1，3-丙二醇，(R)-β-羥基異丁酸

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)是一種專性好氧的革蘭氏陰性菌，屬于醋酸桿菌科，以能夠不完全氧化很多糖醇類化合物而著稱，而其大多數(shù)參與反應(yīng)的酶位于細(xì)胞膜上，催化反應(yīng)生成的相應(yīng)產(chǎn)物(醛、酮以及有機酸等)幾乎能夠全部分泌到培養(yǎng)基中，催化反應(yīng)過程無需通過透膜運輸，大大提高了其應(yīng)用價值，相關(guān)研究和應(yīng)用越來越受到研究人員的重視［1－6］。

光學(xué)活性β-羥基異丁酸，是具有不對稱碳原子的雙功能性物質(zhì)，作為有機合成的基礎(chǔ)材料，廣泛用于合成多種生理活性物質(zhì)，其合成方法一直是人們研究的熱點。單一構(gòu)型的R型β-羥基異丁酸可以作為有機合成的手性砌塊參與其它重要手性分子的合成。目前，R型β-羥基酸的制備一般采用化學(xué)拆分的方法，存在副產(chǎn)物如S型β-羥基酸多，后續(xù)分離困難的缺陷，不能滿足有關(guān)領(lǐng)域的需要，而生物轉(zhuǎn)化法具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性。目前已有利用Gluconobacter roseus IAM 1841，Acetobacter sp.和Acetobacter pasteurianus DSM 8937不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究，但是β-羥基異丁酸的得率都比較低。目前，利用微生物氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究中，最高的產(chǎn)物濃度也只有 29 g/L［7－10］，因此有必要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的濃度。本文主要以氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞為生物催化劑，利用其立體選擇性和區(qū)域選擇性的不完全氧化功能，催化2-甲基-1，3-丙二醇生成光學(xué)純(R)-β-羥基異丁酸，確定了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的組成，并對全細(xì)胞催化過程進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

氧化葡萄糖桿菌DSM 2003(Gluconobacter oxydans DSM 2003)，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室保藏。

1.2 儀器與試劑

恒溫?fù)u床，上海欣鑫自動化設(shè)備有限公司;3.7 L發(fā)酵罐，瑞士比歐生物工程公司;高效液相色譜，美國安捷倫1100 series。

2-甲基-1，3-丙二醇和β-羥基異丁酸甲酯購自西格瑪奧德里奇公司，其余試劑為市售分析純。

1.3 菌體培養(yǎng)

1.3.1 菌體搖瓶培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:山梨醇73.0 g/L，酵母粉18.4 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，KH2PO41.52 g/L，MgSO4·7H2O 0.47 g/L。接種后置于搖床內(nèi)在28℃，250 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 菌體發(fā)酵罐培養(yǎng)

在3.7L發(fā)酵罐中配制2 L培養(yǎng)基。發(fā)酵期間主要控制參數(shù)如下:(1)溶氧。通氣量控制在300 L/h，發(fā)酵罐罐壓控制在0.3～0.6×105Pa，最低攪拌轉(zhuǎn)速控制在400 r/min，當(dāng)發(fā)酵罐溶氧降至30%以下時，提高轉(zhuǎn)速以增加溶氧，最高轉(zhuǎn)速為1 000 r/min。(2)pH值。自動流加2 mol/L的NaOH溶液，保持pH值在6.0左右。(3)溫度。培養(yǎng)過程中溫度保持在28℃。

1.4 2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)

1.4.1 搖瓶轉(zhuǎn)化

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配成一定菌體濃度的菌懸液，加入一定量的底物2-甲基-1，3-丙二醇，反應(yīng)體系為10 mL，置于50 mL的三角燒瓶中，于28℃、250 r/min下反應(yīng)。搖瓶轉(zhuǎn)化實驗均做3個平行樣，取實驗數(shù)據(jù)平均值。

1.4.2 3.7 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化

通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓和通氣速率來控制溶氧在30%以上。間隔0.5～1 h取樣用氣相色譜分析底物濃度，隨時調(diào)整底物流加速度，使反應(yīng)器內(nèi)的底物濃度控制在5 g/L左右。

1.5 產(chǎn)物的分離純化

轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心除去菌體，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。經(jīng)半制備色譜分離純化得到目標(biāo)產(chǎn)物。

1.6 分析方法

1.6.1 2-甲基-1，3-丙二醇測定方法的確定

具體色譜條件為:氣相色譜(Agilent 6890)，DBWAX毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器的溫度為280℃。升溫程序為:100℃保持2 min，然后以20℃/min升溫至180℃，保持1 min，再以30℃/min升溫至220℃，保持5 min。

1.6.2 β-羥基異丁酸測定方法的確定

液相色譜條件:高效液相色譜(Agilent 1100 series)，ZORBAX SB-Aq 柱，柱溫30℃，進(jìn)樣 5 μL，流動相為0.1%的稀磷酸溶液，流速1 mL/min，紫外210 nm波長下檢測。進(jìn)樣前，樣品經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾。

1.6.3 β-羥基異丁酸對映體過量值測定條件的確定

(R，S)-β-羥基異丁酸甲酯標(biāo)品用HP-chiral 20B手性柱在Agilent 6890氣相色譜儀上進(jìn)行分析。樣品預(yù)處理:1 mL轉(zhuǎn)化液加入2 mL甲醇(含3%H2SO4)，在密閉的條件下于80℃反應(yīng)3 h，生成甲酯后加入2 mL CHCl3萃取，然后用氣相色譜進(jìn)行分析。

色譜條件:氣相色譜(Agilent 6890)，HP-chiral 20B毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為120℃，檢測器的溫度為180℃，流速為0.7 mL。升溫程序為:80℃保持0.2 min，然后以2.5℃/min升溫至85℃，保持0.5 min。然后以1.5℃/min升溫至95℃，保持0.5 min。再以1℃/min升溫至105℃，保持10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的產(chǎn)物生成情況分析

將氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC分析，出現(xiàn)3個產(chǎn)物峰(圖1)。為了弄清反應(yīng)過程，優(yōu)化反應(yīng)條件，有必要對這3個產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

圖1 G.oxydans不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

首先對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。反應(yīng)液經(jīng)離心除去菌體，低溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用半制備色譜(Waters)進(jìn)行分離純化，色譜柱為Atlantis prep dC18OBD(Waters，5 μm，Φ19 mm ×100 mm)，流動相為0.1%的磷酸溶液，流速為10 mL/min，上樣量為1 mL，分別收集3個組分。將3個組分分別于低溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后用半制備色譜分別進(jìn)行2次純化，流動相為5%的甲醇溶液。

產(chǎn)物的鑒定。先將2次純化之后收集到的組分直接用GC-MS檢測，第1組分和第3組分未能檢測到結(jié)果，而第2組分經(jīng)檢測為2-甲基丙烯醛，結(jié)果如圖2。

圖2 第2組分的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

通過對2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化過程推斷分析，第1和第3組分很有可能是有機酸，所以先對產(chǎn)物進(jìn)行衍生化，然后用氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析。根據(jù)圖3和圖4可知，第1組分是目標(biāo)產(chǎn)物β-羥基異丁酸，第3組分是2-甲基丙烯酸。2個副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸可能的形成途徑是:底物2-甲基-1，3-丙二醇在氧化葡萄糖酸桿菌乙醇脫氫酶的作用下首先生成中間產(chǎn)物β-羥基異丁醛，而β-羥基異丁醛在氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞其它酶的作用下發(fā)生脫水反應(yīng)而形成2-甲基丙烯醛，繼續(xù)氧化后生成2-甲基丙烯酸。副產(chǎn)物形成的確切途徑有待于進(jìn)一步研究。

圖3 第1組分衍生物的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

圖4 第3組分衍生物的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的反應(yīng)過程

2.2.1 底物濃度對產(chǎn)物生成和選擇性的影響

由圖5可知，氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇的效率和選擇性對底物濃度有依賴性。在底物濃度較低時，隨著初始底物濃度的增加，反應(yīng)效率也隨之升高，在底物濃度為30 g/L時產(chǎn)物濃度達(dá)到最高。隨著底物濃度的進(jìn)一步提高，由于底物對細(xì)胞的活性產(chǎn)生明顯地抑制，催化效率開始出現(xiàn)下降。產(chǎn)物的對映體選擇性(e.e.)隨著底物濃度的增加而降低。綜合轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物光學(xué)純度考慮，確定反應(yīng)體系中的底物濃度為5 g/L。

2.2.2 細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系中的菌體量會直接影響參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速度以及最終的轉(zhuǎn)化效果。由圖6可知，細(xì)胞濃度對產(chǎn)物的光學(xué)純度沒有太大影響。轉(zhuǎn)化效率隨著細(xì)胞濃度的增加而逐漸提高。當(dāng)細(xì)胞濃度超過20 g/L時，隨著細(xì)胞濃度的進(jìn)一步提高，轉(zhuǎn)化效率基本不再變化。因此，從高效利用菌體的角度出發(fā)，確定氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞濃度為20 g/L。

圖5 底物濃度對轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

圖6 細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.3 pH值對2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

由于酶的構(gòu)型與其離子化狀態(tài)有關(guān)，因此通過改變pH值可以改變酶反應(yīng)的選擇性。由圖7可知，反應(yīng)體系的pH值為5.5時，轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物的光學(xué)純度達(dá)到最高，由此確定反應(yīng)的最適pH值為5.5。

圖7 pH對轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.4 溫度對2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化的影響

不同的溫度下，菌體酶的活性不同，反應(yīng)速率會有所變化，立體選擇性也會有所不同。在合適的溫度下，酶系能表現(xiàn)最大的活性。由圖8中可知，當(dāng)溫度小于28℃時，隨著溫度的升高，活化分子增加，酶催化活性提高，轉(zhuǎn)化速率也在提高;而當(dāng)溫度大于28℃時，隨著溫度升高轉(zhuǎn)化速率開始下降，且產(chǎn)物光學(xué)純度也略有下降，因此選擇該轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適溫度為28℃。

圖8 溫度對轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.5 在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物對菌體生長和細(xì)胞催化活性的影響

為了研究菌體培養(yǎng)階段添加醇類物質(zhì)對菌體轉(zhuǎn)化能力的影響，實驗中選取了乙醇、乙二醇、1-丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、甘油、1-丁醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇和 2-甲基-1，3-丙二醇等化合物，于接種前添加在培養(yǎng)基中，添加濃度分別為0.1%。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，然后取相同量菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，底物濃度為5 g/L，轉(zhuǎn)化1 h后，用HPLC測定轉(zhuǎn)化液中的β-羥基異丁酸濃度。將轉(zhuǎn)化液衍生化后用GC測定β-羥基異丁酸的光學(xué)純度。結(jié)果如表1所示，在培養(yǎng)基中添加不同誘導(dǎo)物，對菌體轉(zhuǎn)化活性產(chǎn)生不同程度的影響，對選擇性的影響不大。在培養(yǎng)基中添加0.1%的1，2-丙二醇和乙二醇，菌體轉(zhuǎn)化活性均有較大提高，但乙二醇對菌體的生長有一定的抑制作用;在培養(yǎng)基中添加0.1%的2-甲基-1，3-丙二醇、甘油和2，3-丁二醇，菌體轉(zhuǎn)化活性也有一定幅度提高。

在最優(yōu)搖瓶轉(zhuǎn)化條件下，經(jīng)過10 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到20.5 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到88.6%和95.3%。

2.3 在3.7 L生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇

采用上述最適條件，在3.7 L反應(yīng)器中進(jìn)行氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇的反應(yīng)。為了消除底物對細(xì)胞活性的抑制，采取流加策略維持反應(yīng)體系中的底物濃度不超過5 g/L，結(jié)果如圖9所示。在反應(yīng)開始后10 h內(nèi)，反應(yīng)非常迅速。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物積累到30 g/L時，產(chǎn)物抑制效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，反應(yīng)速率下降。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 4 h時，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到50.2 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。相比于搖瓶中的轉(zhuǎn)化結(jié)果，發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化率和積累的(R)-β-羥基異丁酸濃度都有明顯的提高。同時對副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的濃度進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)它們都是很微量的，濃度都小于1 g/L。

表1 添加劑對氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞生長、光學(xué)選擇性和催化活性的影響

圖9 在3.7 L發(fā)酵罐中補料分批轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

3 結(jié)論

在氧化葡萄糖酸桿菌催化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的過程中，有副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的生成，但濃度都小于1 g/L。在所考察的影響因素(溫度、pH值、初始底物濃度和細(xì)胞濃度等)中，底物濃度對產(chǎn)物的合成效率和選擇性的影響最顯著，產(chǎn)物選擇性隨著底物濃度增加而降低，5 g/L的底物就會對細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制。在菌體培養(yǎng)過程中，添加0.1%的1，2-丙二醇對菌體生長、立體選擇性和催化活性有一定的促進(jìn)作用。最終，在溫度28℃、pH值5.5、細(xì)胞濃度20 g/L、流加底物(≤5 g/L)的情況，3.7L反應(yīng)器中(R)-β-羥基異丁酸的產(chǎn)量達(dá)到50.2 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。

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Enantioselective Oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to β-hydroxyisobutyric Acid Using Whole Cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003

Wei Guo-dong，Wei Dong-zhi，Lin Jin-ping
(State Key Lab of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

β-Hydroxyisobutyric acid(β-HIBA)is an important chemical commodity，which is used in the synthesis of Captopril and other optically active compounds.Microbial asymmetric oxidation of 2-methyl-1，3-propandiol using resting cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003 was investigated for the synthesis of R-enantiomers of β-HIBA.The results indicated that the concentration of R-β-HIBA reached 20.5 g/L with a molar conversion rate of 88.6%and the optical purity of 95.3%at 10 h under the following conditions:temperature 28℃，pH5.5，substrate concentration 5 g/L and cell concentration 20 g/L.Biamass，stereo-selectivity and cell activity of Gluconobacter oxydans DSM 2003 were improved when 0.1%1，2-propanediol or ethylene glycol was added in the culture medium.Under the optimized reaction conditions in 3.7 L bioreactor，the concentration of R-β-HIBA reached 50.2 g/L with a molar conversion rate of 90.5%and the optical purity of 93.2%at 24 h in a 2-l batch reaction.It was proved efficient and a potential process for the oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to(R)-β-HIBA.

Gluconobacter oxydans，bioconversion，2-methyl-1，3-propandiol，β-hydroxyisobutyric acid

博士(林金萍為通訊作者)。

*國家973計劃項目基金(No.2009CB724703)和生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室專項經(jīng)費(No.2060204)資助

2010－01－19，改回日期:2010－05－25