雷公藤甲素對血管緊張素II誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

陳朝紅 洪亦眉 秦衛(wèi)松 曾彩虹 劉志紅

各種損傷 (免疫,毒物,感染,高糖,局部缺血等)均可觸發(fā)足細(xì)胞損傷和缺失。足細(xì)胞缺失達(dá)到一定程度后,殘存的足細(xì)胞代償性工作,這種長期應(yīng)激狀態(tài)將加速足細(xì)胞的損傷和脫落,導(dǎo)致更多足細(xì)胞丟失,從而啟動足細(xì)胞受損的惡性循環(huán),血管緊張素 II(Ang II)可放大這一效應(yīng)。足細(xì)胞表達(dá) Ang II的 1型受體(AT1R)和 2型受體(AT2R),Hoffmann等[1]發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞高表達(dá) AT1R的大鼠在血壓無增高、出現(xiàn)微量蛋白尿時,足細(xì)胞發(fā)生病變,表現(xiàn)為足突融合和足細(xì)胞胞體脫落,逐步進(jìn)展為局灶節(jié)段硬化,證實 Ang可直接作用于足細(xì)胞。因此,長期以來,Ang II作為足細(xì)胞損傷治療的靶點,抑制 Ang II的產(chǎn)生或抑制其與受體結(jié)合的藥物可延緩腎小球疾病進(jìn)展。由于雷公藤甲素對腎小球足細(xì)胞疾病具有廣泛的治療作用[2-7],而 Ang II是介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的重要因素,并參與了腎小球疾病的進(jìn)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對足細(xì)胞損傷有直接的保護(hù)和修復(fù)作用,可拮抗氨基核苷嘌呤霉素對足細(xì)胞的損傷,穩(wěn)定足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)[8]。針對雷公藤甲素能否拮抗 Ang II導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷,我們體外觀察了雷公藤甲素對 Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。

材料與方法

藥品 雷公藤甲素由中國藥品生物制品檢定所提供。樣品經(jīng)高效液相層析分析,純度 ＞99%。雷公藤甲素以二甲基亞砜(DMSO)配制成 10mg/ml的儲存液,儲存于 -20℃冰箱,實驗前應(yīng)用時,用培養(yǎng)液新鮮稀釋成所需濃度,DMSO的濃度不超過0.001%(V/V)。

試劑和儀器 Ang II(Sigma);RPMI-1640(GIBCO)培養(yǎng)液中,含 10%滅活小牛血清(四季青生物工程技術(shù)研究所,杭州);青霉素、鏈霉素各 100 U/ml;重組小鼠 γ干擾素(IFN-γ)(R＆D),CM-H2DCFDA(GIBCO),羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(cytosleleton),緊密連接蛋白 1(ZO-1)單抗(Zymed),FITC標(biāo)記的兔抗小鼠 IgG(DAKO),抗p-38、抗 C-Jun氨基端激酶(JNK)、抗細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2(ERK1/2)磷酸化和非磷酸化抗體,HRP標(biāo)記的兔抗小鼠 IgG、山羊抗兔 IgG和驢抗山羊 IgG(上?？党?,p-38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑 SB203580,ERK MAPK抑制劑 U0126,JNK MAPK抑制劑 SP600125均購自 Sigma,增強的化學(xué)發(fā)光 試劑 ECL(上海康成),顯影液、定影液(樂凱),激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510)。

足細(xì)胞培養(yǎng) 永生化溫度敏感小鼠足細(xì)胞系(heat-sensitive mouse podocytes,HSMPs)由美國華盛頓大學(xué) Shankland教授惠贈。HSMPs由 H-2KbtsA58轉(zhuǎn)基因小鼠的腎小球分離培養(yǎng)獲得。tsA58為溫度敏感 SV40大 T抗原,其表達(dá)受 IFN-γ誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控。足細(xì)胞于 33℃,在重組小鼠 IFN-γ(150 U/ml)誘導(dǎo)條件下足細(xì)胞增生,而在 37℃不含IFN-γ的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10～14 d,足細(xì)胞停止增生,獲得分化表型。

足細(xì)胞的藥物處理 Ang II以 10-6,10-7,10-8mol/L的濃度加入培養(yǎng)足細(xì)胞作用 2h,作為足細(xì)胞損傷的體外研究模型;本研究觀察了雷公藤甲素對 Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,以及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及其下游 MAPK信號通路與雷公藤甲素保護(hù)作用的關(guān)系。在觀察雷公藤甲素對足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究中,雷公藤甲素(1,3,10 ng/ml)與足細(xì)胞預(yù)孵育 30～60 min后,再加入含Ang II(10-7mol/L)的培養(yǎng)基,繼續(xù)作用 2h;在雷公藤甲素抑制 Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究中,雷公藤甲素(10 ng/ml)與足細(xì)胞預(yù)孵育 30 min,再加入含 Ang II(10-7mol/L)的培養(yǎng)基,繼續(xù)作用 5～120 min;以及 p-38 MAPK通路抑制劑 SB203580(25μmol/L),ERK MAPK抑制劑 U0126(25 μmol/L),JNK MAPK抑制劑SP600125(25μmol/L)足細(xì)胞預(yù)孵育 30min,再加入含 Ang II(10-7mol/L)的培養(yǎng)基,繼續(xù)作用 2h。

足細(xì)胞 Ang受體 mRAN定量 分化 14 d的HSMP經(jīng) Ang II和雷公藤甲素處理后,使用 trizol試劑(凱基生物)提取 RNA。采用 RT-PCR法對足細(xì)胞 AT1R和 AT2R mRNA進(jìn)行定量。小鼠 AT1R和AT2R以及 GAPDH引物序列分別為:AT1R sense:5'-GGAAACAGCTTGGTGGTG-3',AT1R antisense:5'-CTGAATTTCATAAGCCTTCTT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為556bp;AT2Rsense:5'-TATGCTCAGTGGTCTGCTG G-3',AT2R antisense:5'-TCTCTCTCTTGCCTTGGA GC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為 427bp;GAPDH sense 5‘-ATGAC ATCAAGAAGGTGGTG-3‘,GAPDH antisense 5‘-CA TACCAGGAAATGAGCTTG-3‘,擴(kuò)增產(chǎn)物為 177 bp;引物均由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系包括:1μl的 cDNA,100 nmol上游引物,100 nmol下游引物,200μM dNTP,1×緩沖液,2.5 mMmg2+,1U Taq酶,2μl DMSO混合,加水至 50μl。 PCR反應(yīng)條件為94℃,45s,55℃,45s,72℃,45s,共 30個循環(huán);72℃,7 min。PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,用Brand Leader Application Version 3.00圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶灰度及其面積相對百分比進(jìn)行分析,以GAPDH光密度值作校正。

熒光顯微鏡觀察足細(xì)胞骨架蛋白 接種于chamber slides(Nunc)中的各組細(xì)胞,37℃ PBS洗三次,75%冰乙醇固定 10 min后,洗去固定液,加入0.5%Triton X-100透膜 5 min,洗滌,室溫避光條件下羅丹明-鬼筆環(huán)肽孵育 30 min,PBS洗三次,甘油封片,共聚焦熒光顯微鏡下(LSM510,Carl Zeiss)觀察結(jié)果,掃描采集圖像。

免疫熒光染色分析足細(xì)胞 ZO-1的表達(dá)與分布接種于 chamber slides中的各組細(xì)胞,PBS洗三次。用 2%多聚甲醛室溫固定 30 min;0.5%Triton X-100室溫破膜 5 min和 5%BSA室溫封閉 30 min;加抗小鼠 ZO-1單抗,室溫孵育 2h,空白對照孔僅加抗體稀釋液;然后加 FITC標(biāo)記的抗小鼠二抗室溫反應(yīng) 30 min,PBS洗滌,PI套染細(xì)胞核 1 min,PBS洗滌,吹干,甘油封片,共聚焦顯微鏡下觀察,掃描采集圖像。

流式細(xì)胞儀分析熒光探針 CM-H2DCFDA標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi) ROS[9]2 ml CM-H2DCFDA(10μmol/L)加入六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的足細(xì)胞,藥物作用足細(xì)胞后,用 PBS洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 CM-H2DCFDA,0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(FACSARIA,BD)分析,使用激發(fā)波長 488 nm,發(fā)射波長 525 nm的檢測參數(shù),以平均熒光強度(mean fluorescence index,MFI)表示細(xì)胞內(nèi)ROS含量,每例樣品測定10 000個細(xì)胞。

Western blotting檢測雷公藤甲素對足細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響 25 cm2培養(yǎng)瓶中的各組細(xì)胞以預(yù)冷的 PBS液洗二次,加入 100μl預(yù)冷裂解液,冰浴 5 min,刮勺收集樣本,4℃ 12 000 r/min離心 10 min,取上清,以 BCA法測定提取蛋白濃度。每個樣本取50μg蛋白加入等體積 2×SDS上樣緩沖液煮沸變性后,預(yù)制的 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,14V×16h濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)載標(biāo)本蛋白的硝酸纖維素膜浸入含 5%脫脂奶粉的 TTBS(20 mM Tris-HCl,p H=7.4,150 mM NaCl,0.1%Tween-20),室溫封閉 1h,加入一抗(磷酸化 p38,ERK及 JNK,總 p38,ERK,JNK及 GAPDH,1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜,TTBS洗滌 15 min×4次后,加入 HRP標(biāo)記的山羊抗兔或驢抗羊二抗(1∶5 000稀釋),室溫孵育 1h,充分洗滌后,用增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL,上?？党?檢測標(biāo)本膜上的信號,所有目的條帶與內(nèi)參均在同一張膜上檢測,X片記錄實驗結(jié)果。利用上海復(fù)日圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶的分析。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01時統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

雷公藤甲素對足細(xì)胞 Ang受體表達(dá)的影響在 mRNA水平,RT-PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖電泳中出現(xiàn)556 bp和 427 bp的目的條帶,顯示我們體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞系表達(dá) AT1R和 AT2R。進(jìn)一步的定量實驗顯示,不論是Ang II單獨作用,還是雷公藤甲素單獨作用,或雷公藤甲素與Ang II聯(lián)合作用,均不影響足細(xì)胞 AT1R和 AT2R的表達(dá)水平(圖1)。

雷公藤甲素對 Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架蛋白破壞的保護(hù)作用 足細(xì)胞于 37℃,無 IFN-γ的培養(yǎng)基中分化 14 d,觀察骨架結(jié)構(gòu)的形態(tài),結(jié)果顯示,正常分化的足細(xì)胞,細(xì)胞骨架呈絲狀結(jié)構(gòu),密度大,絲強勁有力,沿細(xì)胞呈極性分布(圖2A),Ang II呈劑量依賴性破壞足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。10-8mol/L Ang II對足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)無明顯的損傷作用,部分細(xì)胞出現(xiàn)F-actin變細(xì);10-7mol/L Ang II干預(yù) 2h,足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)被明顯破壞,細(xì)胞骨架的極性消失,排列紊亂,部分足細(xì)胞 F-actin出現(xiàn)溶解(圖 2B);10-6mol/L Ang II作用后,F-actin幾乎完全解聚,少數(shù)細(xì)胞尚有殘存的被切斷的絲狀結(jié)構(gòu)。雷公藤甲素與足細(xì)胞預(yù)孵育 30 min后,再加入 Ang II作用 2h,足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)得以很好的保存,雷公藤甲素的保護(hù)亦呈劑量依賴性,10 ng/ml雷公藤甲素的保護(hù)作用較 3 ng/ml更為明顯(圖 2C、D),但雷公藤與足細(xì)胞預(yù)孵育 30 min或 60 min,其對足細(xì)胞的保護(hù)作用無明顯差異。

圖1 足細(xì)胞血管緊張素 II(Ang II)的 1型受體(A)與 2型受體(B)

圖2 雷公藤甲素對血管緊張II(Ang II)誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架破壞的保護(hù)作用(IF,×400)

雷公藤甲素對 Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞間細(xì)胞斷裂的保護(hù)作用 正常分化的足細(xì)胞,ZO-1沿細(xì)胞邊界呈均勻連續(xù)的線狀分布,細(xì)胞邊緣光滑,細(xì)胞間連接緊密。Ang II呈劑量依賴性破壞足細(xì)胞的細(xì)胞間連接。Ang II(10-8mol/L)作用足細(xì)胞 2h,ZO-1連續(xù)的線性分布消失,出現(xiàn)皺褶,但無明顯的斷裂;Ang II(10-7mol/L)組細(xì)胞 ZO-1表達(dá)和分布出現(xiàn)明顯改變,ZO-1出現(xiàn)明顯的斷裂(圖 3B);Ang II(10-6mol/L)組細(xì)胞 ZO-1的破壞進(jìn)一步加劇,表達(dá)減弱、斷裂,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,細(xì)胞間間隙增大。雷公藤甲素與足細(xì)胞預(yù)孵育 30 min后,能夠有效拮抗 Ang II對足細(xì)胞細(xì)胞間連接蛋白的破壞,雷公藤甲素的保護(hù)亦呈劑量依賴性,10 ng/ml雷公藤甲素的保護(hù)作用較 3 ng/ml更為明顯(圖 3C、D),但雷公藤與足細(xì)胞預(yù)孵育 30 min或 60 min,其對足細(xì)胞的保護(hù)作用無明顯差異。

圖3 雷公藤甲素對血管緊張素II(Ang II)誘導(dǎo)的足細(xì)胞間細(xì)胞斷裂的保護(hù)作用(IF,×400)

雷公藤甲素抑制 Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生 Ang II(10-7mol/L)作用10 min即可誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi) ROS的明顯增加,是基礎(chǔ)值的近三倍,并持續(xù)到 30 min。雷公藤甲素(10 ng/ml)或抗氧化劑 N乙酰半胱氨酸(NAC)(10 mmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后,能夠有效遏制 Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生。與此相平行,足細(xì)胞骨架蛋白的熒光染色也證實,抗氧化劑能夠阻斷 Ang II對足細(xì)胞的損傷,進(jìn)一步說明了 ROS介導(dǎo)了 Ang II對足細(xì)胞的損傷。雷公藤甲素抑制 ROS的產(chǎn)生無疑是阻斷 Ang II對足細(xì)胞損傷作用的重要機(jī)制(圖4)。

圖4 雷公藤甲素抑制Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生

雷公藤甲素抑制 Ang II誘導(dǎo)的 MAPK信號通路的活化 Ang II(10-7mol/L)可誘導(dǎo) MAPK三條信號通路的活化,p-38和 JNK MAPK信號通路較早發(fā)生活化。Western blot結(jié)果顯示,Ang II刺激 10min后,p-38和 JNK MAPK的磷酸化水平即顯著升高,分別是對照組的 5.1倍和 4.5倍,并持續(xù)到 60 min。ERK MAPK磷酸化水平在 Ang II作用 30min后達(dá)到高峰,并持續(xù)到 60 min。雷公藤預(yù)處理細(xì)胞后,能夠有效地遏制 Ang II誘導(dǎo)的 MAPK信號通路的活化,p-38,ERK和 JNK MAPK的磷酸化水平顯著降低(圖5)。足細(xì)胞骨架蛋白的熒光染色發(fā)現(xiàn),p-38、ERK MAPK抑制劑 SB203580和 U0126能拮抗 Ang II對足細(xì)胞的損傷,而 JNK MAPK抑制劑對 Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷無明顯的保護(hù)作用(圖6)。

討 論

雷公藤用于治療腎炎已有 30多年的歷史,能明顯減少微小病變,局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)和膜性腎病患者的蛋白尿[2-5]。動物實驗和臨床研究顯示,雷公藤甲素對糖尿病腎病(DN)的蛋白尿也有一定的療效[10,11]。近年來隨著對蛋白尿形成機(jī)制研究的深入,足細(xì)胞病變在大量蛋白尿發(fā)生中的重要性得到了充分的認(rèn)識。足細(xì)胞損傷是 DN發(fā)病的早期事件,如微量白蛋白尿(MAU)、腎小球肥大等的重要病因,與腎小球硬化、腎功能下降有關(guān)系,因此人們將DN也歸因于足細(xì)胞病。不同病因的足細(xì)胞疾病發(fā)展到一定程度,有共同的病理機(jī)制推動腎小球病變進(jìn)展直至腎小球球性硬化。Ang II就是導(dǎo)致足細(xì)胞受損惡性循環(huán)的一個重要因素,臨床試驗和實踐均顯示,有效地控制血壓、抑制 Ang II的生成或作用,以及減少蛋白尿幾乎延緩所有腎小球疾病的進(jìn)展[9]。雷公藤甲素對多種以足細(xì)胞病變?yōu)橥怀霰憩F(xiàn)的腎小球疾病的療效提示,雷公藤甲素可能作用于推動疾病進(jìn)展的一個共同因素。我們前期研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素對免疫因素和非免疫因素介導(dǎo)的蛋白尿的產(chǎn)生均有防治作用[6,7]。體外實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對嘌呤霉素氨基核苷(PAN)所致的足細(xì)胞損傷有直接的保護(hù)和修復(fù)作用,可拮抗 PAN對足細(xì)胞的損傷,穩(wěn)定足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)[12]。結(jié)合臨床上觀察到雷公藤對足細(xì)胞病的廣泛療效,我們進(jìn)一步觀察了雷公藤對 Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的影響。

圖5 雷公藤甲素抑制 MAPK信號通路的活化

圖6 p-38 MAPK和ERK MAPK信號通路介導(dǎo) Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架損傷

腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活是足細(xì)胞損傷的重要因素。一些因素,如高糖,高血壓可刺激局部,包括足細(xì)胞內(nèi) RAS的激活,導(dǎo)致 Ang II釋放增加[13]。研究證實足細(xì)胞上有 ATIR與 AT2R表達(dá),是 Ang II作用的靶細(xì)胞。Ang II可誘導(dǎo)足細(xì)胞肥大,刺激足細(xì)胞分泌 IV型膠原 α3鏈的產(chǎn)生,刺激整合素 β1分泌和整合素連接激酶合成[14,15],誘導(dǎo)裂孔膜成分,如 nephrin表達(dá)和分布的改變[16]。更為重要的是,有研究表明,Ang II可影響足細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞間的緊密連接[17]。以肌動蛋白為中心的細(xì)胞骨架是各種損傷因素作用于足細(xì)胞引起足細(xì)胞損傷的“共同通路”[18],足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)又是主要由 F-actin、α-actinin和 synaptopodin組成,它們之間在結(jié)構(gòu)和功能上互相支撐、相互影響,其中 actin是足細(xì)胞的基本骨架蛋白,對維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。不論引起足突形態(tài)變化的因素是什么或損傷的部位在何處,大部分情況下均可先影響足細(xì)胞骨架而后引起足突融合的形態(tài)改變,同時足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子的改變也能以不同的方式與細(xì)胞骨架發(fā)生作用從而引起足突融合。細(xì)胞間緊密連接蛋白 ZO-1分位于裂孔隔膜的胞質(zhì)內(nèi),是裂孔膜分子(nephrin和 podocin)與 actin連接的橋梁,在裂孔隔膜完整性和信號傳導(dǎo)及穿膜蛋白復(fù)合體組成中起重要作用[17]。我們的研究表明,Ang II呈劑量依賴性解聚足細(xì)胞胞質(zhì)中應(yīng)力纖維,破壞足細(xì)胞間細(xì)胞連接,是 Ang II損傷足細(xì)胞的分子基礎(chǔ)。失去骨架支撐以及細(xì)胞間連接松散的足細(xì)胞易于從基膜脫落,是 DN足細(xì)胞數(shù)目減少的病理基礎(chǔ)。如果預(yù)先加入雷公藤甲素處理,Ang II上述作用被明顯的減弱,足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)得到了很好的保存,拮抗Ang II對足細(xì)胞細(xì)胞間連接蛋白的破壞。上述研究證實雷公藤甲素對 DN的療效與其對足細(xì)胞直接保護(hù)作用有關(guān)。那么雷公藤甲素為何對多種因素造成的足細(xì)胞損傷均有明顯的保護(hù)作用,是否因為不同損傷因素通過共同機(jī)制影響足細(xì)胞功能呢?

Ang II通過細(xì)胞上表達(dá)的 1型和 2型受體發(fā)揮生物學(xué)作用,高糖和機(jī)械牽張等因素可誘導(dǎo) AT1R的表達(dá)[19]。我們的研究結(jié)果顯示,雷公藤甲素并不影響足細(xì)胞上 AT1R和 AT2R的表達(dá),提示雷公藤甲素的作用靶點可能在細(xì)胞內(nèi)的下游信號通路。

氧化應(yīng)激參與了多種腎小球疾病的發(fā)病過程,包括 DN的發(fā)生發(fā)展[20-23]。足細(xì)胞不僅是 ROS作用的靶細(xì)胞,同樣也是產(chǎn)生 ROS的源頭。研究表明,PAN可刺激足細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生[12,24],ROS是PAN導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的初始因素[25]。而 Ang II可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞[26],血管平滑肌細(xì)胞[27],成纖維細(xì)胞[28]等多種細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn),Ang II同樣刺激足細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生,Ang II(10-7mol/L)作用 10 min即可誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi) ROS的明顯增加,是基礎(chǔ)值的近三倍,足細(xì)胞骨架蛋白的熒光染色證實,抗氧化劑 NAC能夠阻斷 Ang II對足細(xì)胞的損傷。進(jìn)一步說明 ROS介導(dǎo)了 Ang II對足細(xì)胞的損傷。而雷公藤甲素(10ng/ml)預(yù)處理細(xì)胞后,能夠有效抑制 Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對 ROS的影響參與了其對 PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,該機(jī)制同樣介導(dǎo)了雷公藤甲素對 Ang II所致足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

細(xì)胞內(nèi) ROS可直接攻擊細(xì)胞,或作為類似第二信使的信號分子激活氧化還原敏感性信號通路,如核因子 κB、MAPK、己糖胺等。其中 MAPK是足細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路,nephrin可通過 p-38和 JNK MAPK激活轉(zhuǎn)錄因子的激動蛋白,而 podocin可明顯加強 nephrin的這一信號傳遞[29],MAPK通路的活化與足細(xì)胞損傷,足突融合和蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)[30]。MAPK家族主要有三條亞信號通路,即經(jīng)典的 p-38 MAPK通路,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)通路,c-un氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)途徑。我們研究發(fā)現(xiàn),Ang II(10-7mol/L)可誘導(dǎo) MAPK三條信號通路的活化,雷公藤預(yù)處理細(xì)胞后,能夠有效地遏制 Ang II誘導(dǎo)的MAPK信號通路的活化,p-38,ERK和 JNK MAPK的磷酸化水平顯著降低。足細(xì)胞骨架蛋白的熒光染色發(fā)現(xiàn),p-38、ERK MAPK抑制劑 SB203580和U0126能拮抗 Ang II對足細(xì)胞的損傷,而 JNK MAPK抑制劑對 Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷沒有明顯的保護(hù)作用,JNK信號通路的活化在足細(xì)胞損傷中的作用還有待進(jìn)一步研究。

上述研究表明,雷公藤甲素對 Ang II導(dǎo)致的足細(xì)胞的損傷有直接的保護(hù)作用,表現(xiàn)為拮抗 Ang II誘導(dǎo)的骨架蛋白解聚,拮抗 Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞間連接分子的重排。雷公藤甲素的上述作用與細(xì)胞內(nèi)ROS及下游的 p-38、ERK MAPK信號通路密切相關(guān)。雷公藤甲素干預(yù)Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷可能部分參與了其對腎小球疾病的療效。

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