酮戊二酸改性殼聚糖微球的制備及其對來氟米特的緩釋

曾 涵,龔蘭新,涂 翔,郭梅菊

新疆師范大學生命科學與化學學院,烏魯木齊 830054

酮戊二酸改性殼聚糖微球的制備及其對來氟米特的緩釋

曾 涵＊,龔蘭新,涂 翔,郭梅菊

新疆師范大學生命科學與化學學院,烏魯木齊 830054

采用反相懸浮法制備交聯(lián)殼聚糖微球,再與α-酮戊二酸反應(yīng)生成 Schiff堿,以NaBH4還原制得改性殼聚糖微球。用 FT-I R,SEM和 XRD進行表征。并以來氟米特 (LEF)為模型藥物,考察了其緩釋效果。結(jié)果顯示:微球?qū)λ幬锏淖畲蟀饴蕿?94%,載藥量為 62%,在緩釋初期 2 h內(nèi)微球平均釋放藥量的 16%,后期則呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢。本論文采用的微粒的藥物承載量和釋放速度既保證了藥物的藥效又降低了藥物釋放速率過快引起的對人體的不良反應(yīng)。

殼聚糖;微球;來氟米特;緩釋

來氟米特(LEF)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的異惡唑類衍生物,是一種治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)為主的新免疫調(diào)節(jié)劑。體外試驗顯示其作用于細胞的二氫乳清酸去氫酶 (DHODH),使核內(nèi)的尿嘧啶核苷單磷酸(rUMP)的合成受到抑制,從而使活化的的 T淋巴細胞生長受到抑制,降低自身免疫反應(yīng),對 RA有一定療效[1]。但來氟米特的不良反應(yīng)也較多,特別是藥物釋放初期速率較快時有較大概率發(fā)生下列不良反應(yīng)[2]:胃腸道反應(yīng) (如腹瀉、惡嘔、腹痛、口腔潰瘍、消化不良等)、皮疹、可逆性脫發(fā)、體重下降、一過性肝酶升高、間質(zhì)性肺炎。為提高其在炎性關(guān)節(jié)局部的藥物濃度,增強抗炎作用,減少全身給藥引起的不良反應(yīng),文獻[3]將來氟米特制成貼片,并對其含量進行了測定,研究了其體外釋放度及釋放藥物特性。但仍然存在短時間內(nèi)釋藥量較大,釋放藥物速率偏快,再加之才用的藥物載體及抗氧化劑等對生物體不友好,生物相容性較差,從而使其實際應(yīng)用受到一定限制。殼聚糖(CTS)由于其無毒,可生物降解,生物相容性較好,被廣泛用于藥物載體的制備[4-5]。殼聚糖在酸性較大介質(zhì)中易于溶解而造成流失,對其進行化學改性以提高 CTS的耐酸性能和載藥量,降低藥物釋放初期的釋放量和釋放速度 (特別是對人體有較大毒副作用的藥物)是目前研究的熱點之一[6]。本文采用反相懸浮法制備酮戊二酸改性 CTS微球,反應(yīng)式如圖 1所示,并研究其對 LEF的緩釋效果。制備的改性 CTS微球耐酸性能優(yōu)于未改性的殼聚糖[7],載藥量 62%高于文獻[3]報道的 34%,在緩釋初期 2 h內(nèi)微球平均釋放載藥量的 16%,較文獻[3]報道的相同時間內(nèi)微球平均釋放藥量 36%有相當幅度的下降,拓寬了殼聚糖的的使用范圍也改進了LEF的進藥方式,有效降低了藥物對人體的毒副作用。

圖 1 修飾殼聚糖微球的合成Fig.1 Synthesis of the modified Chitosan microsphers

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

殼聚糖(CTS):購自浙江玉環(huán)海洋生物化學有限公司,脫乙酰度 94.3%,黏度 86 mPa.s;α-酮戊二酸,硼氫化鈉均購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;聚乙二醇 (PEG)2000,液體石蠟,環(huán)氧氯丙烷, Span80購自廣東汕頭市西隴化工廠,以上試劑均為分析純,文中其余試劑如非特殊說明也為分析純。

UV2100紫外可見分光光度儀 (日本島津公司);NEXUS470型傅里葉變換紅外光譜儀 (美國Nicolet);Y4Q型 X-射線衍射儀(中國丹東射線儀器公司);S3500N掃描電鏡 (日本 Hitachi);安科 TGL-16B型高速臺式離心機;FD-1B-50型冷凍干燥機。

1.2 α-酮戊二酸改性 CTS微球的制備

將 25 g CTS溶于 3.5%的乙酸溶液,放置過夜。加入少量 PEG2000,攪拌均勻,傾倒入液體石蠟中。加入 Span80乳化 30 min,加入甲醛反應(yīng) 1 h。將反應(yīng)液倒入乙醇-10%NaOH溶液的混合液中,靜置分層,抽濾,用石油醚、乙醇和水洗滌。NaOH溶液堿化,加入環(huán)氧氯丙烷溶液 75℃反應(yīng) 2 h,抽濾,水洗,乙醇洗滌。在稀HCl溶液中65℃反應(yīng)8 h,抽濾,水洗,10%NaOH溶液洗,再用水洗至中性。在 3.5%的乙酸溶液加入α-酮戊二酸直到溶液 pH值達到4.7。在此 pH值下于 39℃反應(yīng) 10 h。用 10% NaOH溶液調(diào)節(jié) pH在 6.0左右,滴加 10%NaBH4溶液還原,繼續(xù)攪拌 2 h。靜置過濾,水洗,乙醇洗,最后以乙醇索氏提取 50 h,于 45℃真空干燥,得α-酮戊二酸改性CTS微球。

1.3 緩釋效果測定

1.3.1 α-酮戊二酸改性 CTS包封LEF微球的制備

將 10 g酮戊二酸改性 CTS加入 50 mL HCl溶液 (HCl濃度1.0 mol/L)使其被溶脹,然后持續(xù)磁力攪拌下再加入等體積不同濃度的LEF甲醇溶液(甲醇質(zhì)量濃度為 5.0 g/L),繼續(xù)攪拌30 min,LEF即包封于微球之中。

1.3.2 樣品中LEF含量的測定

按文獻[8]方法,由于來氟米特在波長 260 nm處有最大吸收,空白基質(zhì)沒有干擾,故選用此波長為測定波長。采取文獻[8]所述的標準加入法測定樣品中LEF含量。

1.3.3 LEF在改性 CTS微球中的包封率及 LEF載藥量的測定

將 1.3.1中所提到的等體積不同濃度的 LEF甲醇溶液于 2℃,以 15000 r/min超離心 30 min,取上清液用紫外分光光度計于 260 nm處測定游離的LEF濃度,按下列公式計算包封率。而空白微球采用同樣方法制備,經(jīng)冷凍干燥后用于計算載藥量。

微球?qū)EF的包封率 (%)=(總 LEF的量 -游離LEF的量)/總LEF量 ×100%

微球?qū)EF的載藥量 (%)=(總 LEF的量 -游離LEF的量)/微球質(zhì)量 ×100%

1.3.4 包封LEF的修飾 CTS微球LEF體外釋放度測定

于 5 g載藥微球中加入 8 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH 7.4),于 39℃中速振蕩,定時取樣后以緩沖溶液補充。取出的樣品于 2℃,以15000 r/min超離心 30 min,取上清液用紫外分光光度計于 260 nm處測定游離的 LEF濃度,計算釋放藥量,檢測緩釋效果。參照文獻[8]方法測定包封來氟米特的修飾 CTS微球的體外釋放度。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性 CTS微球的 FT-IR分析

采用 KBr壓片法,測得原料 CTS和改性微球的紅外光譜圖如圖 2。圖中 b為酮戊二酸改性 CTS微球的紅外吸收圖,與母體 CTS相比,由于氨基被酰胺基取代,1596 cm-1的 N-H強吸收峰減弱,1654 cm-1為脂肪酸中 C=O伸縮吸收峰,3200～3500 cm-1范圍的O-H和N-H伸縮振動的吸收峰變寬,說明分子中存在羧基。在 1030～1350 cm-1的吸收峰變寬,說明這是-OH與C-O-C彎曲振動吸收峰的混合峰。

圖 2 殼聚糖(a)和修飾微球(b)的 FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of(a)Chitosan and(b)modified microsphere

2.2 改性 CTS微球的 XRD分析

圖 3為CTS和改性 CTS微球的 X射線衍射譜圖,掃描范圍 5～30°,掃描速率 2°/min,CuKα輻射,管壓40 kV,管流 40 mA?？梢?CTS在2θ為11.6°、20.2°處有兩個結(jié)晶峰。而改性 CTS微球在 11.6°附近的衍射峰幾乎完全消失,20.2°附近的衍射峰明顯減弱,無定型面積反而相對增加。以上現(xiàn)象說明α-酮戊二酸改性 CTS微球破壞了原有殼聚糖母體分子的二級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致母體分子結(jié)晶度大為降低,利于與LEF作用而形成包封的藥物微球。

圖 3 (a)殼聚糖和(b)修飾殼聚糖微球的 XRD圖譜Fig.3 XRD diagramsof(a)Chitosan and(b)modified Chitosan microspheres

2.3 改性 CTS微球的 SEM觀察及粒徑

圖 4為α-酮戊二酸改性 CTS微球的掃描電鏡圖?？梢娭频玫漠a(chǎn)物為較為均勻的球形結(jié)構(gòu)。隨機測量 20個微球的粒徑,求其平均值,得出改性 CTS微球的平均粒徑為60μm。

2.4 改性 CTS微球的溶脹性

稱取一定量改性 CTS微球樹脂,在不同 pH值的緩沖溶液中浸泡 6 h。過濾后稱量,計算溶脹率:溶脹率 =(濕樹脂質(zhì)量 -干樹脂質(zhì)量)/干樹脂質(zhì)量。結(jié)果表明,隨著 pH值的升高,溶脹率先降后升,在 pH 9.6附近有最小值。改性 CTS微球為兩性聚電解質(zhì),于強酸和強堿條件下的溶脹性都較大,而在等電點時溶脹性最小,可以看出,改性 CTS微球的等電點大約為 9.6。

圖 4 修飾殼聚糖微球的 SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM image ofmodified Chitosan microspheres

2.5 LEF濃度對包封率的影響

由圖 5可見,隨著LEF在甲醇溶液中濃度的增大(溶液中都含有 2 g修飾 CTS微球樹脂),LEF的包封率初始大體不變,隨著 LEF濃度的進一步加大,包封率逐漸下降,這是因為來氟米特的空間位阻很大,當濃度較大時,分子間的排斥力會增強,先包裹與微球內(nèi)部或吸附于修飾殼聚糖微粒表面的LEF分子會阻止更多的分子與微球作用并將其排斥出去。在LEF濃度為 4.0 g/L時,測得的包封率為94.3%。

圖 5 LEF濃度變化對包封率的影響Fig.5 Effect of LEF concentrations on LEF encapsulation efficiency

2.6 修飾 CTS微球載藥量

圖 6是 LEF在甲醇溶液中的初始質(zhì)量濃度對修飾 CTS微球載藥量的影響 (溶液中都含有 2 g修飾 CTS微球樹脂)。從圖中可以看出,隨著 LEF濃度的增大,微球?qū)EF的載藥量會增加。當LEF濃度為 6.0 g/L時,微球?qū)?LEF的載藥量能達到62.4%,高于文獻[3]報道的 34%。LEF濃度的加大,與修飾 CTS微球發(fā)生吸附作用的LEF總量會加大,故載藥量會增大,但LEF達到一定濃度之后,由于空間位阻和修飾殼聚糖微球表面吸附位飽和的雙重因素作用使得當LEF濃度進一步加大之后,載藥量不會再增加,甚至略有下降。

圖 6 LEF質(zhì)量濃度變化對載藥量的影響Fig.6 Effect ofLEF concentration on LEF loading

2.7 體外釋放度測定

采用前述文獻[9]采用的溶出度測定法進行包封來氟米特藥物的修飾 CTS微球的 LEF體外釋放度測定(溶液中都含有2 g修飾CTS微球樹脂)。圖7列出了不同載藥量微球在緩沖液中的釋放效果。圖中可見:隨著載藥量的增加,修飾 CTS微球在藥物釋放的最初 2 h內(nèi)釋放的藥量從 8%上升到24%,在后期則均呈緩慢釋放,36 h內(nèi)釋放的藥量超過60%。

圖 7 不同載藥微球的釋藥曲線ig.7 LEF released of differentLEF loading in microspheres C(LEF):g/L:B.6.0;C.8.0;D.10.0

1 Hu JH(胡晉紅),Lv SF(呂隨峰),Liu JY(劉繼勇).Research progress on cure effect of leflunomide for RA.J Chin New Pham(中國新藥雜志),2001,10:294-297.

2 Smolen JS,Kalden JR,Scott DL.Efficacy and safety of Leflunomide compared with placebo and sulphasalazine in active RA:a double-blind,randomized,multicenter trial.Lancet,1999,53(9149):259.

3 XiW(奚煒),Hu JH(胡晉紅),ZhuQG(朱全鋼),Liu JY (劉繼勇).Preparation of leflunomide patch and its release characteristicsin vitro.Phar m Care&Res(藥學服務(wù)與研究),2004,4:240-242.

4 Harish Prashanth KV,Tharanathan RN.Controlled release of alpha-lipoic acid through incorporation into natural polysaccharide-based gel beads.Food Sci&Tech,2006,10:1-6.

5 Xin JY(辛嘉英),Zhang FS(張復(fù)升)Li D(李冬).The synthesis of chitosan microspheres microspheres for macromolecular drugs slow—release.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),1996,8(3):92-95.

6 Yang T,Chou C.Hydrocolloids as emulsifiers and emulsion stabilizers.Food M icrobio,2005,(97):237-242.

7 Wu XF(武雪芬),Hu JM(胡建梅),Hou Y M(侯益民),etal.Preparation of chitosan-g-salicylic acid polymer.Journ Chin-M ed Univ(中國醫(yī)科大學學報),2006,19:503-506.

8 Castro P,Nasser H,Abrah?o A,et al.Aspirin and indomethacin reduce lung inflammation of mice exposed to cigarette smoke.B io Phar m,2009,77:1029-1039.

9 Xie Y(謝宇),Shang XX(尚曉嫻),Yan LS(顏流水). Preparation of hydroxypropyl-chitosan nanospheres and their controlled release in vitro.J Appl Chem(應(yīng)用化學),2009, 26:195-197.

Preparation of Chitosan M icrospheresM odified byα-Ketoglutaric Acid and Their Controlled Releasein vitro

ZENG Han1＊,GONGLan-xin1,TU Xiang1,GUO Mei-jv1
Academy of Life Science and Chem istry,Xinjiang Nor mal University,U rum uqi 830054,China

Chitosan microsphereswere prepared by inverse phase suspension method.The Chitosan was modified by reducing Schiff’s bases formed from the reaction ofα-ketoglutaric acid Chitosan.The structure ofmicrosphereswas characterized by FT-I R,SEM and XRD.Leflunomide(LEF)was taken as the typical drug to determine the controlled release in vitro.Results from tests indicate the highest encapsulation efficiency and load of LEF reached to 94%and 62%respectively.Modified Chitosan microspheres released 16%ofLEF in average within initial 2 h,and it continuously release the entrapped drugwith a slower rate.Load ofmicrospheres and amount of drug release ofmicrospheres adopted in this article ensure drug’s efficacy and reduce the unfavorable effect induced by over-fast release rate.

Chitosan;microsphere;leflunomide(LEF);controlled release

1001-6880(2010)02-0289-04

2009-03-16 接受日期:2009-05-25

＊通訊作者 Tel:86-991-4332417;E-mail:zenghan1289@163.com

R285;Q58;0629

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