丁香酚抑制日本沼蝦應(yīng)激反應(yīng)效果的研究

何新龍,傅洪拓,龔永生,吳 滟,熊貽偉,蔣速飛

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部水生動(dòng)物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放試驗(yàn)室,無(wú)錫 214081

丁香酚抑制日本沼蝦應(yīng)激反應(yīng)效果的研究

何新龍,傅洪拓＊,龔永生,吳 滟,熊貽偉,蔣速飛

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部水生動(dòng)物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放試驗(yàn)室,無(wú)錫 214081

本實(shí)驗(yàn)以丁香酚和日本沼蝦為對(duì)象,研究了丁香酚對(duì)日本沼蝦因溫度的急劇變化和形態(tài)測(cè)量所造成的應(yīng)激反應(yīng)的抑制效果。結(jié)果顯示,丁香酚濃度為 500 mg/L時(shí),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的存活率開(kāi)始呈顯著下降趨勢(shì)的溫差幅度分別為 10和 14℃;當(dāng)溫差為 18℃時(shí),對(duì)照組存活率為 0,實(shí)驗(yàn)組存活率為 0.653±0.033;當(dāng)溫差達(dá)到10℃后,實(shí)驗(yàn)組存活率明顯高于對(duì)照組存活率 (P<0.05)。形態(tài)測(cè)量結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的斷肢率顯著低于對(duì)照組,而存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。研究表明,丁香酚可明顯提高日本沼蝦存活率,并顯著抑制日本沼蝦的應(yīng)激反應(yīng)。

丁香酚;日本沼蝦;麻醉劑;應(yīng)激反應(yīng)

日本沼蝦 (M acrobrachium nipponense)又名“青蝦”,廣泛分布于我國(guó)水域,是淡水漁業(yè)資源重要組成部分。近幾年來(lái),日本沼蝦性成熟早,上市規(guī)格小使得其遺傳改良的研究受到相關(guān)水產(chǎn)研究部門(mén)的極大重視。但日本沼蝦對(duì)外界環(huán)境的變化具有強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)作用,這一特殊生物學(xué)特性及抗應(yīng)激技術(shù)手段的缺乏使得對(duì)日本沼蝦進(jìn)行遺傳改良操作的進(jìn)程受到阻礙。麻醉劑能有效抑制應(yīng)激反應(yīng)。迄今,丁香酚(Eugenol)作為唯一一種被發(fā)現(xiàn)的對(duì)日本沼蝦具極高麻醉作用效果的麻醉劑[1],是植物丁香 (Flos caryophflli)及丁香羅勒油 (O leum ocim i gratissim i)的主要成分,其代謝物能夠快速的從血液和組織中排出,不會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生突變物質(zhì),而且價(jià)廉易得,對(duì)人體健康無(wú)影響[2,3]。本實(shí)驗(yàn)以形態(tài)測(cè)量和溫度的急劇改變等常規(guī)遺傳操作為研究?jī)?nèi)容,探討了丁香酚對(duì)日本沼蝦抗應(yīng)激作用效果,具有實(shí)際意義。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所使用的日本沼蝦為野生太湖青蝦,個(gè)體體長(zhǎng)為 3～5 cm。丁香酚購(gòu)于江西省吉安市恒誠(chéng)天然香料提煉廠購(gòu)得,含丁香酚 99.9%以上,比重為1.038～1.06。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備工作

實(shí)驗(yàn)前,日本沼蝦在水族箱里低密度 20尾/m2暫養(yǎng)至少 1周,水溫為12℃,正常養(yǎng)殖管理,確保實(shí)驗(yàn)時(shí)所用蝦為健康無(wú)斷殘肢蝦。丁香酚在使用前用無(wú)水乙醇以 10∶1的比例混合均勻后稀釋成 500 mg/L的麻醉劑溶液[1]。另設(shè)置幾組水族箱,水溫分別控制在 12、18、22、26、30℃,充分曝氣以備用。

1.2.2 溫度應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

選擇健康無(wú)斷肢日本沼蝦作為實(shí)驗(yàn)材料。分別挑選 30尾未經(jīng)丁香酚處理的日本沼蝦為對(duì)照組,投放到與暫養(yǎng)水體溫差分別為 0、6、10、14、18℃水體中,觀察和記錄入水后 10 s內(nèi)、1 h的應(yīng)激反應(yīng)狀況,最后統(tǒng)計(jì) 1周后的沼蝦存活率。實(shí)驗(yàn)組沼蝦需在12℃水溫條件下用已經(jīng)配好的500 mg/L丁香酚溶液麻醉至沼蝦喪失維持身體平衡能力、步足喪失活動(dòng)能力、開(kāi)始側(cè)臥水底、泳肢呈規(guī)律性擺動(dòng)時(shí)投放到各溫差水體中。每組30尾蝦,逐個(gè)進(jìn)行麻醉。觀察、記錄方法以及 1周后存活率的統(tǒng)計(jì)方法均同對(duì)照組。暫養(yǎng)期間,正常養(yǎng)殖管理。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 形態(tài)測(cè)量應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

選擇健康無(wú)斷肢日本沼蝦作為實(shí)驗(yàn)材料。用游標(biāo)卡尺離水測(cè)量沼蝦蝦體各節(jié)以及第二步足各節(jié)的長(zhǎng)、寬度并用電子稱(chēng)對(duì)蝦體進(jìn)行稱(chēng)重,以模擬實(shí)際形態(tài)測(cè)量操作方法和步驟,同時(shí)記錄步足斷殘情況。室溫離水操作,操作完成后放回原水體暫養(yǎng)觀察記錄。1周后,統(tǒng)計(jì)存活率情況。實(shí)驗(yàn)組沼蝦需在 12℃水溫條件下用已經(jīng)配好的 500 mg/L丁香酚溶液麻醉至沼蝦喪失維持身體平衡能力、步足喪失活動(dòng)能力、開(kāi)始側(cè)臥水底時(shí)開(kāi)始測(cè)量稱(chēng)重等實(shí)驗(yàn)操作。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行組間 t檢驗(yàn)和組內(nèi)單因素方差分析 (one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 溫度應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)丁香酚麻醉后的實(shí)驗(yàn)組在溫度急劇改變后, 10 s內(nèi)仍保持側(cè)臥水底、泳足有規(guī)律的擺動(dòng)的麻醉狀態(tài)。入水 1 h后,溫差幅度為 18℃時(shí),14.7%日本沼蝦死亡,身體軀干混濁呈白色,85.3%恢復(fù)正常活動(dòng)狀態(tài),但反應(yīng)遲鈍。對(duì)照組在溫度急劇改變后表現(xiàn)為:溫差為 0℃和 6℃時(shí),入水 10 s內(nèi)均表現(xiàn)為輕微跳躍現(xiàn)象,入水 1 h后,恢復(fù)正常活動(dòng)狀態(tài)。對(duì)照組在溫差為 14℃以及以上溫度時(shí),入水 10 s內(nèi),跳躍現(xiàn)象表現(xiàn)非常劇烈,并且肌肉開(kāi)始變渾濁呈白色;對(duì)照組在入水 1 h后,溫差為 14℃時(shí),所有青蝦恢復(fù)正常活動(dòng)狀態(tài),但反應(yīng)遲鈍,77.8%的青蝦身體軀干肌肉混濁呈白色;溫差為 18℃時(shí),可導(dǎo)致76.7%青蝦死亡 (表 1)。

表 1 溫度應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)描述Table 1 The description of stress response induced by temperature

注:“D IT”代表“溫差”。Note:D ITmeans difference in temperature.

1周后,統(tǒng)計(jì)存活率。結(jié)果顯示,溫差為 0℃時(shí),對(duì)照組存活率為 0.956±0.019,而溫差為 18℃時(shí)存活率驟降為 0±0.000。實(shí)驗(yàn)組存活率在溫差為 0℃時(shí),存活率為 0.933±0.033,而在溫差為 18℃時(shí)存活率降為 0.653±0.033。對(duì)照組存活率在溫差為6℃以上溫度時(shí),開(kāi)始出現(xiàn)顯著性下降。而實(shí)驗(yàn)組存活率在溫差為10℃以上溫度時(shí)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì),丁香酚的麻醉可提高其對(duì)溫度的耐受力(表2)。

表 2 不同溫度下丁香酚對(duì)實(shí)驗(yàn)存活率的影響Table 2 The effect of eugenol on experimental livability (Means±SD)at different temperature differences (D IT)

2.2 形態(tài)測(cè)量應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示,對(duì)照組平均斷肢率為 0.278± 0.019,而實(shí)驗(yàn)組斷肢率為 0,t檢驗(yàn)顯示差異顯著。對(duì)照組平均存活率為 0.605±0.058,而實(shí)驗(yàn)組平均存活率為 0.941±0.019。兩者差異顯著(P<0.05) (表 3)。

表 3 形態(tài)測(cè)量應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of stress response induced by measurement ofmorphology(Means±SD)

3 討論

丁香酚、MS-222、乙二醇苯醚和苯唑卡因等均是水產(chǎn)常用麻醉劑,合理使用麻醉劑能夠使魚(yú)體安靜,降低采卵、采精、采血等操作時(shí)的應(yīng)激反應(yīng),使操作得以順利進(jìn)行。在運(yùn)輸過(guò)程中,麻醉劑能夠降低魚(yú)體新陳代謝,減少對(duì)魚(yú)體的傷害,從而提高運(yùn)輸存活率[2]。其相關(guān)報(bào)道主要集中在魚(yú)類(lèi)麻醉研究方面[4-7]。丁香酚及其代謝物能夠快速地從血液和組織中排出,不會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有毒和突變物質(zhì),在醫(yī)學(xué)上作為牙科鎮(zhèn)痛劑被廣泛應(yīng)用[3],近幾年來(lái)的研究還表明其有抑菌[8,9]、麻醉[10]、解熱[11]、抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、促進(jìn)透皮吸收[14]、祛蚊[15]等多種藥理活性。1972年,日本的遠(yuǎn)藤發(fā)現(xiàn)丁香酚這種香料對(duì)魚(yú)有強(qiáng)烈的麻醉作用,開(kāi)始將它作為麻醉劑進(jìn)行了系列研究,迄今已被很多國(guó)家如澳大利亞、智利、芬蘭等認(rèn)為丁香酚沒(méi)有殘留期,是合法的水產(chǎn)麻醉劑[16],研究還發(fā)現(xiàn)丁香酚是眾水產(chǎn)用麻醉劑中唯一對(duì)水產(chǎn)甲殼類(lèi)具有顯著效果的麻醉劑[1,17,18]。近幾年來(lái),日本沼蝦經(jīng)濟(jì)性狀的改變使得對(duì)日本沼蝦遺傳改良的研究倍受重視,但遺傳改良操作時(shí)由于應(yīng)激反應(yīng)作用致使實(shí)驗(yàn)操作成功率低、研究進(jìn)程緩慢。因此,選擇丁香酚作為有效麻醉劑研究其抑制日本沼蝦應(yīng)激反應(yīng)效果具有實(shí)際應(yīng)用意義。

從溫度應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,對(duì)照組隨著溫差幅度的加大,應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度逐漸加強(qiáng),至溫差 14℃及其以上時(shí)溫度時(shí),已經(jīng)可以目測(cè)到肌肉因強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的理化性質(zhì)的改變,肌肉變得混濁并呈現(xiàn)白色,甚至這種應(yīng)激反應(yīng)在溫差為18℃時(shí)給對(duì)照組帶來(lái) 76.7%的瞬間死亡率。實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦在溫差為14℃及其以下溫差梯度時(shí),溫度的驟變并未帶來(lái)沼蝦表觀上的改變,只在溫差幅度高達(dá) 18℃時(shí),才導(dǎo)致 14.7%的瞬間死亡率,部分沼蝦身體軀干混濁呈白色。從最終存活率結(jié)果看,溫差為 0℃時(shí),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的存活率分別為 0.956和0.933,兩者比較無(wú)差異,觀察統(tǒng)計(jì)表明這是由于暫養(yǎng)期間部分沼蝦脫殼后被殘食,導(dǎo)致一定的死亡率的原因。溫差為 6℃及其以上溫度時(shí),實(shí)驗(yàn)組存活率顯著大于對(duì)照組存活率,說(shuō)明丁香酚抑制溫度的驟變帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)的效果是顯著的。

在進(jìn)行沼蝦形態(tài)測(cè)量時(shí),對(duì)照組沼蝦頻繁在測(cè)量過(guò)程中掙扎、彈跳,操作不謹(jǐn)慎容易導(dǎo)致步足斷殘。另外,因測(cè)量項(xiàng)目諸多,使得沼蝦長(zhǎng)時(shí)間暴露在離水環(huán)境中。這些操作弊端直接導(dǎo)致對(duì)照組 0.278的斷肢率和 0.605的存活率,與實(shí)驗(yàn)組斷足率 (0)以及存活率(0.941)相比,差異均顯著,說(shuō)明丁香酚有效降低了實(shí)驗(yàn)操作給沼蝦帶來(lái)的機(jī)械損傷作用。

本實(shí)驗(yàn)采用丁香酚的濃度為 500 mg/L。何新龍等[1]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)深度麻醉后的日本沼蝦恢復(fù)所需時(shí)間平均為 18.6 m(22℃)。這種緩慢蘇醒的特性確保了實(shí)驗(yàn)操作的順利進(jìn)行。另外,在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),丁香酚濃度為 300和 400 mg/L時(shí),均可獲得相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,我們認(rèn)為只要丁香酚在所需時(shí)間內(nèi)能使沼蝦處于深度麻醉狀態(tài),均可有效抑制日本沼蝦的應(yīng)激反應(yīng)作用。

研究結(jié)果表明丁香酚是一種能有效抑制日本沼蝦應(yīng)激反應(yīng)的麻醉劑,在有關(guān)研究方面應(yīng)受重視和被推廣應(yīng)用。本研究可為沼蝦遺傳改良研究提供參考依據(jù)。

1 He XL(何新龍),Fu HT(傅洪拓),Gong YS(龔永生),et al.Eugenol as an anesthetic for the freshwater prawnM acrobrachium nipponense.Chin Agric Sci Bull(中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)), 2007,23:620-623.

2 Liu CL(劉長(zhǎng)琳),He L(何力),Chen SQ(陳四清),et al. The summarization to the studies of the anesthetic of fish. Fishery M odernization(漁業(yè)現(xiàn)代化),2007,34(5):21-25.

3 Velisek J,Svobodova Z,Piackova V.Effects of clove oil anaesthesia on rainbow trout.ActavetB rn,2005,74:139-146.

4 Du H(杜浩).Studieson Key Techniques in Incubation,Culture and Transportation ofAmerican ShadA losa sapidissim a. Wuhan:HuazhongAgriculturalUniversity,2005.

5 Zhang CH(張朝暉),Cong JR(叢嬌日),Wang B(王波), et al.The effect of anesthetic eugenol on the oxygen consumption rates ofTrachinotus blochii.M arine Sci(海洋科學(xué)),2003,27(6):11-14.

6 Li CM(李春梅),Huang YJ(黃永堅(jiān)).The study ofMS-222 as an anesthetic to goldfish.J Huanggang Polytechnic(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)),2002,4(4):67-70.

7 Yanar M,Kumlu M.The anaesthetics effects of quinaldine sulphate and/or diazepam on sea bass(D icentrarchus labrax)juveniles.Turk J VetAnim Sci,2001,25:185-189.

8 ZhangMM(章明美),Yang XM(楊小明),Xie JM(謝吉民),et al.Activity screening of 15 crude drug extracts on inhibition ofPropionibacterium acnes.J Jiangsu Univ,M ed Ed (江蘇大學(xué)學(xué)報(bào),醫(yī)學(xué)版),2004,14(3):188.

9 Eady EA,Cove JH,Holland KT,et al.Superior antibacterial actior and reduced incidence of bacterial resistance in minocycline comparex to tetracycline treated acne patients.B r J Der m atol,1990,122:233.

10 Zhao YL(趙艷麗),Yang XL(楊先樂(lè)),Huang YP(黃艷平),et al.The study of effects of clove oil anaesthesia on Pseudosciaena crocea.Fisheries Sci&Tech Infor(水產(chǎn)科技情報(bào)),2002,29(4):163.

11 He J(禾軍),Feng JL(馮甲棣),Zhao H(肇暉),et al. Effects of eugenol on electroactivities of ther mosensitive neurons in arcuate nuclei of guineapig.J Chin M ed Univ(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)),1999.28:13.

12 Tan TH(譚廷華),He XL(何西利),Gao J(高健),et al. The scavenging activities for hydroxyl radical of eugenol. Northwest Phar m aceutical J(西北藥學(xué)雜志),1996,11:30.

13 GaoQ(高崎).The effectsof hydrocinnamyl alcohols and lignans on anti-mutagenic and scavengingNO radical activities. Foreign M edical Sci(國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)),2003,25: 249.

14 Shen Q(沈琦),Cai ZZ(蔡貞貞),Xu LY(徐蓮英).The study of clove on thein vitropereutaneous penetration of 5-fluomuracil.Chin Tradit and Herb D rugs(中草藥),1999, 30:601.

15 Shi SZ(石淑珍),Liu ZJ(劉增加),Yang YS(楊銀書(shū)),et al.The effects of clove-insectifuge banishing the mosquito. Chin J Pest Control(醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制),2003,19:18.

16 Hoskonen P,Pirhonen J.Temperature effects on anaesthesia with clove oil in six temperate-zone fishes.J Fish B iol,2004, 64:1136-1142.

17 Coyle SD,Dasgupta S,TidweIl JH.Comparative eficacy ofanaesthetics for the freshwater prawnM acrobrachium rosenbergii.J W orld Aquaculture Society,2005,36:282-290.

18 Waterstrat PR.Evaluation of eugenol as an anesthetic for the American lobster,Homarus am ericanus.J W orld Aquaculture Society,2005,36:420-424.

The Study on Eugenol aga inst the Stress Response toM acrobrachium nipponense

HE Xin-long,FU Hong-tuo＊,GONG Yong-sheng,WU Yan,X IONG Yi-wei,J IANG Su-fei
Key Open Laboratory for Genetic B reeding of Aquatic Anim als and Aquaculture B iology,M inistry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academ y of Fishery Sciences,W uxi 214081,China

Experiments of eugenol against the stress response ofM acrobrachium nipponense,induced by sharp changes in temperature or the measurement ofmorphologywere perfor med.Experimental result showed that the livability of control group or experiment group began to show a significant declining trend when the temperature difference was 10℃or 14℃ respectively.The livability of control group was 0 while 0.653±0.033 was observed in experiment group when the temperature difference was at 18℃.A higher livabilitywas also obtained in experiment group when compared with control group when tested by t-test at the condition of the temperature difference was up to 10℃(P<0.05).Another result induced bymeasurement ofmorphology showed that the leg-injury rate was remarkable lower in test group(0)than in control group,while the livability in test group was significant higher than that of control group(P<0.05).The studies indicated that eugenol can significantly improve the livability and has an excellent efficacy against the stress response to M acrobrachium nipponense.

eugenol;M acrobrachium nipponense;anaesthetic,;stress response

1001-6880(2010)02-0281-04

2008-06-24 接受日期:2008-09-02

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2006BAD01A13;2006BAD03B07);農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科技跨越計(jì)劃 (2007);江蘇省高技術(shù)研究項(xiàng)目(BG2007328)

＊通訊作者 Tel:86-510-85558835;E-mail:fuht@ffrc.cn

R285;Q813.1

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