雙平板對照篩選跟蹤分離細(xì)菌外排泵抑制劑

楊再昌,楊小生,牛玉樂

1貴州大學(xué)化工學(xué)院,貴陽 550003;2貴州省、中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室,貴陽 550004

雙平板對照篩選跟蹤分離細(xì)菌外排泵抑制劑

楊再昌1＊,楊小生2,牛玉樂1

1貴州大學(xué)化工學(xué)院,貴陽 550003;2貴州省、中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室,貴陽 550004

建立了細(xì)菌外排泵抑制劑的篩選與活性跟蹤方法。準(zhǔn)備 2個平板,一個為普通營養(yǎng)瓊脂平板,另一個為含小蘗堿的普通營養(yǎng)瓊脂平板,通過比較兩個平板含藥紙片周圍抑菌圈的直徑大小判斷篩選結(jié)果,方法可靠穩(wěn)定。篩選發(fā)現(xiàn)某霉菌提取物對細(xì)菌外排泵有抑制活性,經(jīng)活性跟蹤分離,得到單體化合物,經(jīng) NMR鑒定為 4′, 5,7-三羥基異黃酮。方法簡便易行,成本低,適宜于對大批樣本進(jìn)行快速篩選并在分離時進(jìn)行活性跟蹤。

篩選;細(xì)菌外排泵;抑制劑;雙平板

細(xì)菌外排泵 (Bacterial efflux pump)是細(xì)菌將胞內(nèi)毒物運輸?shù)桨猸h(huán)境的蛋白質(zhì)。細(xì)菌基因組學(xué)的研究表明,5%～10%的基因與細(xì)菌的物質(zhì)運輸有關(guān),這部分基因主要編碼外排泵,使細(xì)菌能在不利的環(huán)境中生存下來。幾乎所有抗生素對細(xì)菌來說都是有毒性的,因此抗生素很容易誘導(dǎo)細(xì)菌外排泵的超表達(dá),并可導(dǎo)致交叉耐藥,使細(xì)菌獲得泵出多種抗菌藥物的能力。另外,超表達(dá)外排泵的菌株,還容易導(dǎo)致其它抗菌藥物作用靶點的變異。由此可見,外排泵在細(xì)菌耐藥性形成的過程中扮演著重要角色[1]。

近年來的研究表明,外排泵被抑制后,細(xì)菌可重新恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性,為研制抗耐藥菌藥物提供了新的思路。由于大多數(shù)外排泵在結(jié)構(gòu)上具有高度的同源性,使發(fā)現(xiàn)對多種外排泵均有抑制活性的廣譜抑制劑成為可能,外排泵抑制劑與抗生素組合,將提高或恢復(fù)抗生素的抗菌活性[2]。外排泵是跨膜蛋白的一種,依賴質(zhì)子勢能提供能量,以離體外排泵蛋白為靶點較難實現(xiàn)高通量篩選,基于細(xì)胞的篩選方法被廣泛使用。一種方法是用同位素標(biāo)記外排泵底物(如四環(huán)素),通過測定細(xì)菌胞內(nèi)藥物濃度評價抑制劑的活性;另一方法是構(gòu)建外排泵超表達(dá)菌株,通過測定M I C評價抑制劑的活性[3]。這兩種方法對實驗條件要求較高,有一定技術(shù)難度。

本實驗將銅綠假單胞菌 (ATCC 27853)在亞抑菌濃度的小蘗堿瓊脂平板中不斷傳代,經(jīng)利血平、小蘗堿聯(lián)合抗菌試驗證明,該菌株對小蘗堿的耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)。以小蘗堿為該菌株的外排泵底物,建立了篩選細(xì)菌外排泵抑制劑的雙平板對照法篩選模型,并采用本法進(jìn)行活性跟蹤,從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中分離到活性單體,經(jīng)NMR鑒定為 4′,5,7-三羥基異黃酮(Genistein),經(jīng)熒光分光光度法測定細(xì)菌胞內(nèi)外排泵底物小蘗堿的濃度,進(jìn)一步驗證該單體有抑制細(xì)菌外排泵的作用。

1 材料

銅綠假單胞菌為 ATCC 27853標(biāo)準(zhǔn)菌株,由貴州省、中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室贈送,小蘗堿、利血平為 Sigma公司產(chǎn)品,蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉為北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠產(chǎn)品。熒光分光光度計為島津 RF-540。

2 方法

2.1 用小蘗堿誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥

按常規(guī)方法制小蘗堿含量分別為 350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μg/mL的營養(yǎng)瓊脂平板,首先劃線接種銅綠假單胞菌于 350μg/mL的營養(yǎng)瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)24 h后,釣取生長旺盛的菌落,從低濃度到高濃度,依次接種培養(yǎng),傳 14代后,菌株用小蘗堿含量為1000μg/mL的營養(yǎng)瓊脂平板維持培養(yǎng)備用。

2.2 細(xì)菌外排泵抑制劑的雙平板對照篩選法

銅綠假單胞菌經(jīng)誘導(dǎo)后在含小蘗堿的營養(yǎng)瓊脂平板中生長良好,接種細(xì)菌后,在瓊脂表面貼上紙片,再滴加待篩選的樣本溶液,如果樣本對外排泵有抑制作用,則細(xì)菌不能外排小蘗堿,小蘗堿在細(xì)菌胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用,致紙片周圍形成抑菌圈。因樣本本身也可能具有抑菌作用,還需檢測樣本對不含小蘗堿的營養(yǎng)瓊脂平板上的相同細(xì)菌是否具有抑制作用,不含小蘗堿的平板叫對照平板。如果樣本使含小蘗堿平板的紙片周圍形成抑菌圈,而在對照平板的紙片周圍無抑菌圈,樣本很可能對外排泵有抑制作用,反之,如果一個樣本在兩種平板上都形成抑菌圈,這個樣本應(yīng)與外排泵抑制作用無關(guān),這個方法即雙平板對照法。具體做法見圖 1,準(zhǔn)備 2個 90 mm的培養(yǎng)皿制備瓊脂平板,一個平板為含小蘗堿 256 μg/mL的營養(yǎng)瓊脂平板 (A),另一個為普通營養(yǎng)瓊脂平板(B),樣本用少量甲醇溶解后,用 PBS液(0.2 mol/L,pH 7.2)稀釋成 5 mg/mL的溶液。在平板接種菌液后(105 CFU/mL),貼上紙片,每紙片加 5μL的樣本溶液,紙片載藥量為 25μg,37℃培養(yǎng) 18 h后觀察結(jié)果,記錄抑菌圈直徑 (包括紙片直徑)。用利血平(1號紙片,一種已知細(xì)菌外排泵抑制劑,0.5 mg/mL)作陽性對照。一次可篩選 3個樣本。

2.3 活性單體的跟蹤分離及結(jié)構(gòu)鑒定

采用雙平板對照篩選法發(fā)現(xiàn)某霉菌發(fā)酵液能抑制銅綠假單胞菌外排泵,擴(kuò)大培養(yǎng)得發(fā)酵液 5000 mL,減壓濃縮后,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得 3個提取部位,活性跟蹤發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位活性最強(qiáng),用硅膠柱分離,用石油醚/乙酸乙酯 (3∶1)洗脫,收集得 30份洗脫液,其中第 18至第 20份均有活性,合并后再經(jīng)硅膠柱分離,得到淺灰色粉末。測定化合物理化性質(zhì),用NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.4 細(xì)菌胞內(nèi)小蘗堿濃度的測定

小蘗堿(Berberine)屬異喹啉類生物堿,進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)后,與細(xì)菌的DNA分子結(jié)合,熒光增強(qiáng),進(jìn)入胞內(nèi)的小蘗堿越多,發(fā)出的熒光越強(qiáng),因此,測定熒光強(qiáng)度可以間接反映細(xì)菌胞內(nèi)小蘗堿的量。測定按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[4],即用MH肉湯培養(yǎng)銅綠假單胞菌致A600為 1.8,菌液離心,棄去上清液,沉淀用 20 mmol/L的 HEPES/NaOH(pH 7.0)緩沖液洗滌 3次,菌液用含葡萄糖 10μmol/L的 HEPES緩沖液調(diào)整致A600為 0.3,37℃培養(yǎng)1 h,離心,用HEPES緩沖液洗滌后調(diào)整致A600為 0.15。取菌液 3 mL,加入小蘗堿溶液 0.5 mL(120μg/mL)及活性單體化合物溶液 0.5 mL(配成 64、128、256μg/mL三個濃度,每一濃度做 2管),對照管只加小蘗堿及HEPES/NaOH(pH 7.0)緩沖液,在 0、5、10、15、20、25、30 min時段內(nèi),分別在激發(fā)光波長 355 nm、發(fā)射光波長 517 nm的條件下用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

銅綠假單胞菌ATCC 27853一般作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株,小蘗堿對該菌株的M I C為512μg/mL,經(jīng)小蘗堿誘導(dǎo)后,小蘗堿抑制該菌株的M IC>1000 μg/mL,在 1/4 M I C的小蘗堿營養(yǎng)瓊脂平板中,該菌株生長良好,其菌落生長情況與不含小蘗堿的營養(yǎng)瓊脂平板的情況無差異。當(dāng)小蘗堿濃度提高到1000μg/mL時,該菌株雖然未能被殺死,但菌落變小,生長不良。

雙平板對照篩選法顯示(圖 1),利血平 (1號紙片)在不含小蘗堿的營養(yǎng)瓊脂平板 (B)中對無銅綠假單胞菌無抑制作用,在 1/4 M I C的小蘗堿營養(yǎng)瓊脂平板 (A)中能形成明顯的抑菌圈 (直徑 10.4 mm),說明利血平本身對該菌株無抗菌活性,但通過抑制細(xì)菌外排泵,提高了該菌株對小蘗堿的敏感性;編號為 2的樣本,在 A、B平板中均無抑菌圈,表明該樣本本身無抗菌活性,也不是外排泵抑制劑;編號為 3的樣本,在A、B平板中均形成抑菌圈,表明該樣本本身具有抗菌活性,不一定是細(xì)菌外排泵抑制劑;編號為 4的樣本,抑菌圈直徑 13 mm,和利血平結(jié)果一致,是細(xì)菌外排泵抑制劑。

圖 1 雙平板篩選細(xì)菌外排泵抑制劑Fig.1 Screening for bacterial efflux pump inhibitors by double plates

活性單體化合物(4號樣品)在甲醇中重結(jié)晶得針狀晶體,難溶于水,能溶于丙酮、乙醇、DMSO、甲醇等有機(jī)溶劑,熔點 297℃。1H NMR(Acetone)δ: 13.05(1H,s),9.71(1H,s),8.19(1H,s),8.55 (1H,s),7.46(2H,d,J=6.4 Hz),6.92(2H,d,J= 6.8 Hz),6.43(1H,d,J=2.4 Hz),6.28(1H,d,J= 2.4 Hz)。13C NMR(Acetone)δ:154.3(C-2),123.0 (C-3),181.6(C-4),159.0(C-5),99.8(C-6), 164.9(C-7),94.4(C-8),158.4(C-9),106.1(C-10),123.9(C-1′),131.1(C-2′,6′),115.9(C-3′, 5′),163.9(C-4′)。結(jié)合文獻(xiàn)[5],該化合物鑒定為4′,5,7-三羥基異黃酮 (4′,5,7-trihydroxyisoflavone),即金雀異黃酮(Genistein),結(jié)構(gòu)見圖 2。

圖 2 4′,5,7-三羥基異黃酮Fig.2 4′,5,7-Trihydroxyisoflavone

4′,5,7-三羥基異黃酮能抑制細(xì)菌外排泵,提高細(xì)菌胞內(nèi)小蘗堿的量,結(jié)果見圖 3。加入小蘗堿后,菌液相對熒光強(qiáng)度逐漸上升,4′,5,7-三羥基異黃酮在低濃度(64μg/mL)時對細(xì)菌外排泵已經(jīng)具有明顯的抑制作用,增大濃度后,相對熒光單位進(jìn)一步提高,存在明顯的量效關(guān)系。

圖 3 菌液相對熒光強(qiáng)度曲線Fig.3 Relative fluorescence units of cell

4 討論

近年來隨著對細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的不斷深入,認(rèn)識到細(xì)菌外排泵的超表達(dá)是耐藥性形成的主要原因之一,篩選發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌外排泵抑制劑 (EPIs,Efflux Pump Inhibitors)成為抗菌藥物研究的熱點。第一個被發(fā)現(xiàn)的 EPIs是來源于植物的生物堿利血平,因用量大時有神經(jīng)毒性,故未能與抗菌藥物組成復(fù)合制劑,以后又從植物提取物中分離到一些 EPIs單體化合物,有的已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。在生態(tài)的選擇壓力下,植物可產(chǎn)生一些天然小分子對抗細(xì)菌外排泵,從植物中發(fā)現(xiàn)新的 EPIs的機(jī)會很大[6]。

為了對中藥提取物進(jìn)行普篩,在吸取前人方法的基礎(chǔ)上,我們建立了雙平板對照篩選法,本法采用小蘗堿作為細(xì)菌外排泵底物,通過比較兩個平板含藥紙片周圍有無抑菌圈及抑菌圈的直徑大小,判斷篩選結(jié)果。方法簡便易行,成本低,適宜于對大批樣本進(jìn)行快速篩選并在分離時進(jìn)行活性跟蹤。

篩選發(fā)現(xiàn)某霉菌的提取物能抑制銅綠假單胞菌對小蘗堿的外排作用,經(jīng)活性跟蹤分離、NMR鑒定,活性單體為 4′,5,7-三羥基異黃酮,實驗結(jié)果表明,該化合物提高了細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)小蘗堿的熒光強(qiáng)度。4′,5,7-三羥基異黃酮有多種生物學(xué)活性,同時也是腫瘤細(xì)胞 P-糖蛋白抑制劑,P-糖蛋白是腫瘤細(xì)胞的外排泵[7],可見該化合物是一種廣譜 EPIs。對 4′, 5,7-三羥基異黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,以提高抑制細(xì)菌外排泵的專屬性的研究工作正在進(jìn)行之中。

1 WebberMA,Piddock LJV.The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance.Journal of Antinicrobial Chemotherapy,2003,51:9-11.

2 Lomovskaya O,Warren M,Lee A,et al.Identification and characterization of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa:novel agents for combination therapy.Ant im icrobial Agent and Chemotherapy,2001, 45:105-116.

3 StavriM,Piddock LJ,Gibbons S.Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources.Journal of Antim icrobial Chemotherapy,2007,59:1247-1260.

4 Tegos G,Ster mitz FR,Lomovskaya O,et al.Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant ant imicrobials.Antim icrobial Agent and Chem otherapy,2002,46:3133-3141.

5 Kozerski L,Kamien ski B,Kawe cki R,et al.Solution and solid state 13C NMR and X-ray studies of genistein complexeswith amines.Potential biological function of the C-7,C-5,and C-4-OH groups.O rg B iomol Chem,2003,1:3578-3585.

6 Markham PN.Inhibition of the emergence of ciprofloxacin resistance in Streptococcus pneumonide by the multidrug efflux inhibitor reserpine.Antim icrob Agents Chem other,1999,43: 988-989.

7 Castroa AF,Altenberg GA.Inhibition of drug transport by Genistein in multidrug-resistant cells expressing P-glycoprotein.B iochem ical Phar m acology,1997,53:89-93.

Screen ing for and Bioassay-guided Isolation of Bacterial Efflux Pump Inhibitors by ControlM ethod Based on Double Plates

YANG Zai-chang1＊,YANG Xiao-sheng2,N IU Yu-le11Chem ical Engineering College of Guizhou University,Guiyang 550003,China;2Key Laboratory of Chem istry forNatural Products of Guizhou Province and Chinese Academ y of Sciences,Guiyang 550004,China

To establish the method of screening for and bioassay-guided isolation of bacterial efflux pump inhibitors.Two plateswere prepared.One was nutrient agar plate and anotherwas also nutrient agar plate but contained berberine.The determination of the screening resultswasmade by the measurements of the diameters of the inhibition zone around the discs that to be pasted on the surface of the two plates and contained test samples.The method was reliable and steady. The extractof one kind of themould showed the activity to inhibit bacterial effluxpump.A monomeric compoundwaspurified by bioassay-guided isolation and identified as 4′,5,7-trihydroxyisoflavone by 1H and 13C ofNMR.The screening method for bacterial effluxpump inhibitorswas very simple and cheap forpractice.It is suitable forwho wanted to screen for bacterial efflux pump inhibitors from large quantities of samples.Also it is a good bioassay in isolation.

screening;bacterial efflux pump;inhibitors;double plates

1001-6880(2010)02-0277-04

2008-07-16 接受日期:2008-12-11

貴州大學(xué)博士啟動基金(No.X065008)

＊通訊作者 Tel:86-851-6848659;E-mail:yangzaichang@126.com

R285.5;Q58

A