雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的研究

彭 勝,彭密軍,卜曉英,伍 鋼,胡文彬

吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,張家界 427000

雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的研究

彭 勝,彭密軍＊,卜曉英,伍 鋼,胡文彬

吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,張家界 427000

建立了由高分子化合物聚乙二醇(PEG4000)與葡聚糖 40000(D40)形成的雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙的新方法?？疾炝溯腿◇w系相圖,研究了 PEG4000/D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)、樣品溶液加入量、pH值和溫度等因素對(duì)雙水相成相及桃葉珊瑚甙萃取率的影響。結(jié)果表明:PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 11%,D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、樣品溶液加入量為 8 g,溫度為 60℃,溶液 pH為 7時(shí),雙水相體系對(duì)桃葉珊瑚甙有較高的萃取率,重復(fù)三次可達(dá)到 66.32%,而且萃取得到的桃葉珊瑚甙產(chǎn)品的純度達(dá)到 48.67%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粗提物中的 8.750%。

桃葉珊瑚甙;杜仲葉;雙水相體系;萃取;分離

杜仲 (Eucomm ia u lm oidesOliv)是中國(guó)特有的藥用物種。桃葉珊瑚甙是一種從杜仲葉和皮中分離出來(lái)的環(huán)烯醚萜糖甙,具有促進(jìn)干細(xì)胞再生、明顯抑制乙肝病毒DNA復(fù)制,促進(jìn)膠原蛋白的合成和抗肌肉骨骼老化等多種功效[1-3]。雙水相萃取 (aqueous two-phase extraction,ATPE)是利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來(lái)進(jìn)行萃取的方法。與傳統(tǒng)方法相比,具有如下優(yōu)點(diǎn):不存在有機(jī)溶劑殘留、分相時(shí)間短、能除去大量雜質(zhì)和固體物質(zhì)、易于工程放大和連續(xù)操作等,被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和生物化工、天然活性產(chǎn)物等領(lǐng)域[4-5]。國(guó)內(nèi)外有將該體系用于天然活性成分的研究,但側(cè)重于如何提高目標(biāo)產(chǎn)物萃取率,忽略了目標(biāo)成分與雜質(zhì)的分離[5-6]。針對(duì)這一情況,本文運(yùn)用聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖 40000(D40)體系,在保證分離效果的前提下,較系統(tǒng)地考察了杜仲葉中桃葉珊瑚甙的萃取情況,旨在為桃葉珊瑚甙的分離純化和開發(fā)利用提供新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及化學(xué)試劑

原料:杜仲葉于 2008年 9月采自吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山(經(jīng)吉首大學(xué)廖博儒研究員鑒定系杜仲科杜仲屬植物),50℃干燥,粉碎并過(guò) 40目篩,備用。桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自日本和光純藥業(yè)公司。

試劑:分子量分別為 1000、2000、4000、6000的聚乙二醇(PEG)、葡聚糖 40000(D40)為化學(xué)純,Epstahl試劑[3]、醋酸、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 主要儀器

儀器:UV757CRT型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(中國(guó)上海精密科學(xué)儀器有限公司);R215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCH I);BM400型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 (日本 YAMATO);KQ-250E型超聲波清洗器(中國(guó)昆山超聲儀器有限公司);AEG-220型電子天平 (日本SH IMADZU);LD5-2A型離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙水相體系的制備

在刻度具塞離心管中加入適當(dāng)?shù)?PEG、D40和樣品溶液,使體系質(zhì)量達(dá)到 10 g,溶解,形成雙水相體系。所得體系 PEG富集于上相,下相為 D40相。上相為深褐色,樣品溶液中部分桃葉珊瑚甙和絕大部分雜質(zhì)均分布于此,下相呈亮黃色,部分黃酮類物質(zhì)和桃葉珊瑚甙分布于此。離心分相,分別測(cè)定兩相中桃葉珊瑚甙含量,一次萃取完畢,補(bǔ)充 D40形成新的體系,重復(fù)下一次萃取,按下式計(jì)算[5]:

式中:R-相比;Vb-下相體積,mL;Vt-上相體積, mL;K-桃葉珊瑚甙的分配系數(shù);Cb-下相桃葉珊瑚甙的質(zhì)量濃度,mg/mL;Ct-上相桃葉珊瑚甙的質(zhì)量濃度,mg/mL;Y-萃取率,%。

本研究的目的就是優(yōu)化萃取條件,使得桃葉珊瑚甙盡可能轉(zhuǎn)移到下相,達(dá)到與色素及其他雜質(zhì)的有效分離。

1.3.2 桃葉珊瑚甙的測(cè)定

用甲醇配制成 900μg/mL的桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別量取 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 mL刻度試管中,分別加入 E試劑 1.7 mL,20%鹽酸 0.5 mL,95%的乙醇 2.5 mL,用水定容至 10 mL,在 75℃的條件下顯色 15 min,冷卻后,在分光光度計(jì)上,以試劑空白為參比于 601 nm處測(cè)定其吸光值,繪制曲線方程如下:Y=0.018+ 0.00468X,r=0.9995。式中 X為溶液中桃葉珊瑚甙質(zhì)量濃度 (μg/mL);Y為吸光值,該方程在濃度為0.045-0.45μg/mL范圍內(nèi),Y與 X線性關(guān)系良好。

1.3.3 杜仲葉粗提液的制備

稱取 150 g杜仲葉粉,以 1∶6的料液比加入50%乙醇,于 50℃超聲波輔助提取 40 min,抽濾,收集濾液,濾渣重復(fù)提取一次,合并濾液,真空濃縮,離心,收集上清液(經(jīng)測(cè)定為 1.105 g/mL),冷藏備用。取上清液如 1.3.2進(jìn)行顯色測(cè)定,測(cè)得粗提液中桃葉珊瑚甙含量為 27.56 mg/mL。烘干后測(cè)定,粗提物中桃葉珊瑚甙的含量為 8.750%。

1.3.4 雙水相萃取條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,采用高分子化合物PEG和 D40組成雙水相體系,對(duì) PEG分子量、PEG4000/D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)、樣品溶液加入量、pH值和溫度分別進(jìn)行了考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG與 D40雙水相體系相圖[7]

將已知濃度的 PEG(分子量分別為 1000、2000、4000、6000)溶液逐滴加入 D40的濃溶液中,直至出現(xiàn)渾濁。記下此時(shí)的體系組成并向 D40溶液中加入 1 g水,搖勻待溶液變清后重復(fù)上述操作。將所記錄的體系組成以D40的質(zhì)量百分含量為橫坐標(biāo),以 PEG的質(zhì)量百分含量為縱坐標(biāo),得到雙節(jié)點(diǎn)曲線圖1。

由圖1可見(jiàn),PEG的平均分子量越大,雙節(jié)線越趨向原點(diǎn),成相的臨界濃度越低。因此在 PEG平均分子量 1000～4000之間,達(dá)到臨界濃度時(shí),分子量為4000時(shí)消耗的 PEG和D40最少。而 PEG4000與PEG6000相比,前者 PEG和 D40的濃度范圍寬,有利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。而后者因 PEG分子量過(guò)大,使溶液黏度過(guò)高,不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。因此,選定PEG4000和D40構(gòu)成本實(shí)驗(yàn)的雙水相體系。

圖 1 PEG/D40雙水相體系相圖Fig.1 The phase diagram of PEG/D40 aqueous two-phase system

2.2 PEG4000和D40的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響

PEG4000和 D40的質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須在相圖中雙節(jié)線上方,才能形成雙水相?？拷R界點(diǎn)的系統(tǒng),兩相形成較困難;遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)的系統(tǒng),由于高聚物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,溶液黏度高,兩相分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng),對(duì)分離也不利。因此 PEG4000和 D40的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)適當(dāng)選擇,既要易于形成合適的雙水相體系,又要保證兩相分離時(shí)間盡可能短[8],這樣才有利于目標(biāo)物的萃取。

表 1 PEG4000和D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相體系的影響Table 1 Effectof the percentage of PEG4000 andD40 on the aqueous two-phase system

綜合文獻(xiàn)和相圖的結(jié)果,選定表 1中三組PEG4000/D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)比進(jìn)行試驗(yàn),各組分別加入2.5 g樣品溶液,以超純水補(bǔ)足 10 g,形成雙水相體系。第一組中 D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大,消耗多,致使下相黏稠,取樣困難,而且萃取率升高不明顯。第三組中 PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,而D40較少,使得R、K、Y均減小,結(jié)果也不理想。與第一、三組數(shù)據(jù)相比,第二組中 PEG4000和 D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較適中,試劑消耗較少,且萃取率比較高。因此選定由 11% PEG4000和 8%D40組成雙水相體系進(jìn)行下面研究。

2.3 樣品溶液加入量對(duì)雙水相體系的影響

在室溫下,向 11%PEG4000和 8%D40組成的雙水相體系中分別加入不同質(zhì)量的樣品溶液,考察樣品加入量對(duì)體系的影響,結(jié)果見(jiàn)圖 2。

研究表明,雙水相萃取中單位質(zhì)量相系統(tǒng)中樣品溶液的加入量是一個(gè)十分重要的參數(shù)。

圖 2 樣品溶液加入量對(duì)雙水相體系的影響Fig.2 The effect of leaching solution volume on the aqueous two-phase system

從圖 2可見(jiàn),隨著樣品量的不斷增加,萃取率 Y值不斷增大,由 29%上升至 64.04%。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,在保證總質(zhì)量為 10 g的前提下,除 PEG4000和D40外,其余全部用樣品溶液補(bǔ)足比較合適。

2.4 pH值對(duì)雙水相體系的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 11%的 PEG4000和 8%的D40制備雙水相體系,以樣品溶液補(bǔ)足 10 g,在室溫下,用醋酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系 pH值考察桃葉珊瑚甙的萃取率隨 pH值的變化情況,結(jié)果如圖 3所示。

圖 3 pH值對(duì)雙水相體系的影響Fig.3 The effect of pH value on the aqueous two-phase system

由圖可知,在 pH=5～9范圍內(nèi),Y值隨著 pH值的增大先增大后減小,在 pH為 7時(shí)達(dá)到最大。這主要是因?yàn)樗嵝詶l件不利于桃葉珊瑚甙的萃取;堿性較強(qiáng)時(shí),上下相顏色均發(fā)生明顯改變,由原來(lái)的上相褐色和下相亮黃色,變?yōu)樯舷嗌罹G色和下相綠色。推測(cè)可能是氫氧化鈉導(dǎo)致桃葉珊瑚甙分解。故確定雙水相體系以 pH值 7左右最佳。

2.5 溫度對(duì)雙水相體系的影響

溫度在雙水相分配中也是一個(gè)重要的參數(shù),它主要影響相的高聚物組成。為此,在固定 pH為 7的條件下,考察了溫度對(duì)雙水相體系 (由 11% PEG4000和 8%D40組成)萃取桃葉珊瑚甙的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖 4 溫度對(duì)雙水相體系的影響Fig.4 The effect of temperature on the aqueous twophase system

結(jié)果表明,隨著溫度的升高,相分離速度加快,而且溫度在 30～60℃區(qū)間內(nèi),萃取率上升迅速,溫度超過(guò)60℃后,萃取率略有下降。其原因可能是溫度過(guò)高,導(dǎo)致桃葉珊瑚甙分解;溫度過(guò)低,不利于傳質(zhì),故選定最適溫度為 60℃。

在以上確定的最佳 PEG/D40質(zhì)量分?jǐn)?shù)、樣品加入量、pH值、溫度等條件下,對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行雙水相萃取試驗(yàn) 3次,8 g(含桃葉珊瑚甙 199.53 mg)提取液中有 121.61 mg桃葉珊瑚甙被提取出來(lái) (損失為8.01%),即得到下相對(duì)桃葉珊瑚甙的萃取率為66.32%,并且得到的桃葉珊瑚甙產(chǎn)品的純度達(dá)到48.67%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粗提物中桃葉珊瑚甙的含量8.750%。

3 結(jié)論

綜上所述,雙水相萃取分離杜仲葉桃葉珊瑚甙的最佳體系是:由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 11%PEG4000和 8% D40組成,最佳萃取條件是樣品溶液 8 g,pH值 =7,溫度 60℃。本方法為環(huán)烯醚萜類化合物萃取分離提供了一種有效方法,使桃葉珊瑚甙與樣品溶液中其他物質(zhì)得到有效分離,D40相萃取率達(dá)到 66. 32%以上,桃葉珊瑚甙純度也由粗提物中的 8. 750%提高到 48.67%。該方法具有分相時(shí)間短、除雜能力強(qiáng),分離過(guò)程更經(jīng)濟(jì)、不存在溶劑殘留、萃取率高,可連續(xù)操作、安全方便等優(yōu)點(diǎn)。

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4 LiMQ(李夢(mèng)青),Geng YH(耿艷輝),Liu G M(劉桂敏),et al.Application of aqueous two phase extraction technique in separation and purification of resveratrol.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2006,18:647-649.

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Extraction and Separation of Aucubin from the Leave of Eucomm ia ulm oidesin Aqueous Two-phase System

PENG Sheng,PENGMi-jun＊,BU Xiao-ying,WU Gang,HU Wen-bing
Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chem ical Industry Engineering,Jishou University,Zhangjiajie 427000,China

A new method to extract and separate aucubin from the leave ofEucomm ia u lm oidesOliv.in aqueous twophase system formed by macromolecular compound PEG4000 and dextran 40000 was investigated.The effect of phase map of extraction system,the addition amount of sample solution,pH and temperature were investigated systematically. The results showed that the bestATPSwas composed of 11%PEG4000 and 8%D40,and addition of sample was 8 g at 60℃,pH 7.The highest extraction rate could reach to 66.32%after three times.The content of aucubin in the extract from liquid of aqueous two-phase extraction could rise up to 48.67%from 8.750%.

aucubin;leave ofEucomm ia ulm oidesOliv.;aqueous two-phase system;extraction;separation

1001-6880(2010)02-0264-04

2009-06-03 接受日期:2009-10-27

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目 (08A056);張家界市科技局項(xiàng)目(2008);吉首大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(JGY200907)

＊通訊作者 Tel:86-0744-6313787;E-mail:pengmj163@163.com

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