合歡皮提取物抑制血管生成作用的研究

花 慧,馮 磊,張小平,張蓮芬,金 堅(jiān)＊

1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院天然藥物研究室;2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無錫 214122

合歡皮提取物抑制血管生成作用的研究

花 慧1,馮 磊1,張小平1,張蓮芬2,金 堅(jiān)2＊

1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院天然藥物研究室;2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無錫 214122

本文采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法和體內(nèi)雞胚尿囊絨膜模型、荷瘤模型檢測(cè)合歡皮提取物抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)的增殖、遷移活性,觀察合歡皮提取物的抑制血管生成情況。發(fā)現(xiàn)合歡皮提取物能顯著抑制HMEC-1的增殖 (I C50為 30μg/mL)和遷移,并且呈明顯的劑量依賴性。在體內(nèi)同時(shí)具有抑制雞胚尿囊膜和腫瘤組織中血管生成的作用。

合歡皮;血管生成;內(nèi)皮細(xì)胞

血管生成 (angiogenesis)是指毛細(xì)血管從已存在的血管周圍生成的過程,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與移行、形成新的血管和血管網(wǎng),并且與已存在的血管連接。正常成年人的血管內(nèi)皮細(xì)胞一般處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),生理情況下內(nèi)皮細(xì)胞平均每數(shù)年分裂一次,但在病理狀態(tài)下血管生成是有害的,它能促進(jìn)疾病的必然發(fā)生,主要發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化、固體腫瘤生長及與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相聯(lián)系的慢性炎癥。有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞快速增生,形成血管,從而導(dǎo)致腫瘤組織得到充分的營養(yǎng)供應(yīng),將原發(fā)癌細(xì)胞輸送、轉(zhuǎn)移至靶器官,最終導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移[1-4]。因此,抗血管生成藥物已經(jīng)成為腫瘤治療的重要藥物。本課題首先建立了天然藥物庫,運(yùn)用多個(gè)體內(nèi)、體外模型來篩選有抑制血管生成作用的天然藥物。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了三位具有顯著抑制血管生成作用的天然藥物,合歡皮便是其中之一。

合歡皮是一味常用中藥,為豆科植物合歡 A lbizia julibrissinDurazz.的干燥樹皮,具有解郁安神、活血消腫的功能,用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等癥。文獻(xiàn)報(bào)道合歡皮提取物具有廣泛的體內(nèi)、體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性[5-7]。但它是否具有純粹的抗血管生成作用,以及它的抗腫瘤作用是否與其抑制腫瘤血管形成有關(guān)尚不清楚。

1 材料

1.1 主要儀器

Model 3110細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Ther mo-For ma公司); MK3型酶標(biāo)儀 (Thermo-Labsystems公司);BX-40光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 藥品與試劑

合歡皮、甘草藥材購自江蘇省無錫市山禾藥業(yè)股份有限公司,由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳健偉教授鑒定分別為 A lbizia julibrissinDurazz.的干燥樹皮和 Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根莖。受精白皮種蛋購自無錫馬山養(yǎng)雞場(chǎng)。EGF、MTT、MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基 (Gibco BRL公司),胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺 (華美生物工程公司),CD31單克隆抗體及免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c-nu/nu裸小鼠(來源于上海市腫瘤研究所,雌性)。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

SV40病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代株(HMEC-1,法國國家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院 U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈(zèng)),C51結(jié)腸癌細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供)。

2 方法

2.1 合歡皮提取物的制備

1 kg合歡皮用 10 L的 75%乙醇回流提取兩次(1.5、1 h),合并提取液后減壓濃縮回收乙醇,浸膏冷凍干燥,其干物質(zhì)的得率為 13.45%。甘草提取物的制備與上述方法相同冷凍干燥后得到粉末,干物質(zhì)的得率為 18.45%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HMEC-1細(xì)胞采用MCDB培養(yǎng)液 (由MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基、1μg/mL氫化可的松、10 ng/mL表皮生長因子(EGF)、15%小牛血清和 0.01%L-谷氨酰胺配制成)。C51結(jié)腸癌細(xì)胞采用含 10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上兩種細(xì)胞株置于 37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)傳代,觀察細(xì)胞生長狀況并確保細(xì)胞生長良好。實(shí)驗(yàn)均用處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)

用 0.25%胰酶將 HMEC-1細(xì)胞消化并制成單細(xì)胞懸液,按每孔 6000～7000個(gè)細(xì)胞接種于 96板, 37℃、5%CO2過夜,加入不同濃度的樣品溶液,分別以單純的培養(yǎng)液和未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照,每組設(shè) 8個(gè)復(fù)孔 (實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加MTT(5 mg/mL)20μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,棄上清液,每孔加 DMSO 150μL,37℃孵育 10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè) 490 nm波長處的吸光度(A490)值。按以下公式計(jì)算平均抑制率。

2.4 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制實(shí)

取對(duì)數(shù)生長期的 HMEC-1細(xì)胞,以 105 cell/mL細(xì)胞接種于 24孔板,1 mL/孔,每組設(shè) 4個(gè)平行孔,細(xì)胞貼壁后,沿孔中線劃去細(xì)胞,培養(yǎng)基洗滌,去除死細(xì)胞,分別加水陰性對(duì)照組和合歡皮提取物 30 μg/mL,分別在 0、6、12、24 h.拍照,量取中間空白帶的寬度,記錄。

2.5 CAM血管生成形態(tài)學(xué)檢測(cè)

受精白皮種蛋,參考文獻(xiàn)方法[8]制備雞胚尿囊膜。用打孔器制備直徑為 6 mm的微孔濾膜圓片,濕熱高壓消毒。設(shè)合歡皮提取物給藥組 100、500、1000μg/mL和生理鹽水陰性對(duì)照組。分別取 1 mL以上不同濃度藥物滴于濾紙上,制成藥膜,吹干備用。雞胚培養(yǎng) 3 d后分組,將藥膜貼于 CAM的部位。加藥 48 h后,觀察計(jì)數(shù)藥膜周圍 8 mm內(nèi)大、中、小血管數(shù),并攝影記錄。

2.6 體內(nèi)荷瘤模型小鼠分析血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31分子表達(dá)的影響

用 PBS制成 C51結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞懸液,以 200萬 cell/200μL接種至 8周大 BALB/cnu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤體生長至 5 mm×5 mm大小時(shí),隨機(jī)分成三組:生理鹽水對(duì)照組,甘草提取物陰性對(duì)照(0.4 mL、100 mg/mL),合歡皮提取物用藥組(0.4 mL、100 mg/mL),每組 5只。連續(xù)灌胃給藥 60 d,每天記錄瘤體的長徑和短徑。用藥期間,小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)。處死小鼠后,取出腫瘤稱重記錄,然后按以下公式計(jì)算腫瘤抑制率:腫瘤抑制率 =[1-給藥組平均瘤重/生理鹽水對(duì)照組平均瘤重]×100%。腫瘤組織制成冰凍切片,應(yīng)用 SABC法對(duì)上述冰凍切片進(jìn)行 CD31免疫組織化學(xué)染色,顯微鏡下觀察 (×200)記錄血管數(shù),微血管密度(MVD)的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]的方法。

圖 1 合歡皮提取物對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)增殖的影響Fig.1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on proliferation of HMEC-1

3 結(jié)果

3.1 合歡皮提取物對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果見圖 1,合歡皮提取物對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,其半數(shù)抑制量為 30μg/ mL,而且這種抑制作用有劑量依賴關(guān)系。

圖 2 合歡皮提取物對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HMEC-1)遷移的影響Fig.2 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on migration ofHMEC-1

3.2 合歡皮提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

結(jié)果如圖 2所示,6 h后陰性對(duì)照組細(xì)胞之間的空白帶的寬度較加入合歡皮提取物加以干預(yù)的小。說明HMEC-1經(jīng)合歡皮提取物干預(yù)后遷移能力減弱。

3.3 合歡皮提取物抑制 CAM新生血管的形成

CAM是經(jīng)典的血管生成評(píng)價(jià)模型。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生理鹽水陰性對(duì)照組CAM血管生成非常明顯,整體呈鮮紅色,血管在藥膜下呈放射狀生長,血管粗大,血液充盈,血管分支較多,毛細(xì)血管密度大。合歡皮提取物給藥組濃度為 500μg/mL時(shí)則明顯抑制了血管生成,放射狀生長的血管數(shù)目大為減少,血管主要以零星、雜亂、葉脈樣等表現(xiàn)形式存在,血管細(xì)小,稀疏,血管分支少,血管色淡淺黃,在藥膜片下及周圍局部鮮有血管區(qū),或者血管斷裂或消失,而當(dāng)濃度為 1000μg/mL這些現(xiàn)象更加明顯。結(jié)果表明合歡皮提取物能顯著抑制新生血管生成。結(jié)果如圖3、表 1所示。

圖 3 合歡皮提取物對(duì)CAM新生血管生成的影響(×10)Fig.3 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(×10)

表 1 合歡皮提取物對(duì)CAM新生血管生成的影響Table 1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(±s,n=12)

表 1 合歡皮提取物對(duì)CAM新生血管生成的影響Table 1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(±s,n=12)

＊P<0.05,＊＊P<0.01 vs Control

合歡皮提取物Albizia julibrissin extracts大血管數(shù)Large vessel中血管數(shù)Middle vessel小血管數(shù)Small vessel 0μg/mL(Control) 2.5±0.2 3.5±0.67 19.7±0.47 100μg/mL 2.1±0.34 3.9±0.53 15.6±0.29 500μg/mL 2.6±0.54 2.8±0.97 10.7±0.19＊1000μg/mL 2.5±0.67 2.5±0.27 6.8±0.48＊＊

3.4 合歡皮提取物對(duì)荷瘤模型小鼠的腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31分子表達(dá)的影響

合歡皮提取物用藥組相對(duì)與生理鹽水對(duì)照組抑瘤率高達(dá) 67.5%,而甘草提取物組與生理鹽水對(duì)照組的平均瘤重幾乎無顯著差異結(jié)果見表 2。通過腫瘤組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組中微血管呈棕褐條索狀分布,血管密集。合歡皮提取物用藥組的腫瘤組織的微血管 CD31分子表達(dá)明顯稀少,幾乎觀察不到血管,結(jié)果表明合歡皮提取物具有抑制腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞 CD31分子表達(dá),即降低血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用,從而抑制新生血管形成的作用。而甘草提取物對(duì)新生血管形成沒有明顯抑制作用。

表 2 各組荷瘤裸鼠治療后抑瘤率和微血管密度Table 2 The rate of inhibition(IR)of tumor growth and microvessel density(MVD)of different groups

4 討論

腫瘤的血管系統(tǒng)已成為一個(gè)嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。開發(fā)和研究能破壞或抑制血管生成,有效地阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物是非常有前途的。血管生成抑制劑最大的優(yōu)點(diǎn)在于它不容易產(chǎn)生耐藥性,大多數(shù)實(shí)體瘤都能得到滿意的治療效果。

世界各國目前已經(jīng)開發(fā)出許多血管生成抑制劑,有的正在進(jìn)行Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究,例如血管生成抑素 (angiostatin)、內(nèi)皮抑素 (endostatin)等生物制劑。但是這些藥物毒性大、穩(wěn)定性欠佳、有效濃度高、需要長期注射給藥、價(jià)格昂貴,因此限制了其在臨床上的使用。尋找與開發(fā)無毒、高效、可以口服、價(jià)格便宜的血管生成抑制劑是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。我國的傳統(tǒng)中藥以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),日益受到藥物研究者的重視,從中藥中尋找抗腫瘤血管生成的藥物已成為國內(nèi)外藥物研究的一個(gè)重要策略。

合歡皮作為傳統(tǒng)中藥材,臨床上一直被用作解郁安神類藥物使用?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明,合歡皮提取物具有鎮(zhèn)靜、抗生育、PAF受體拮抗、抗癌和抗炎等作用。迄今為止未發(fā)現(xiàn)以抗新生血管為靶點(diǎn)對(duì)合歡皮進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。本課題組以抑制血管生成活性作為切入點(diǎn),主要研究了合歡皮提取物對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、體內(nèi)抑制血管的形成、以及腫瘤組織中 CD31血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的影響。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的持續(xù)性增殖和遷移是血管生成的基礎(chǔ)及重要特征。人體正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞的更新需要幾百天,而在發(fā)生血管生成的時(shí)候,血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖速度平均只需5 d,而且表現(xiàn)出很強(qiáng)的遷移性。因此藥物具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用,可認(rèn)為其具有抗新生血管的活性。我們研究發(fā)現(xiàn),合歡皮提取物在極低濃度下 (0～100μg/mL)對(duì) HMEC-1表現(xiàn)出明顯的抑制增殖和遷移的活性。這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,IC50為 30μg/mL。當(dāng)濃度為 30μg/mL時(shí),HMEC-1遷移數(shù)目極少,遷移行為幾乎被完全阻斷。提示抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移是合歡皮提取物抗血管生成的重要途徑之一。

現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管樣結(jié)構(gòu)是新生血管的必然過程。通過雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,合歡皮提取物對(duì)體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成和血管新生也有明顯的抑制作用。在腫瘤模型中,以 CD31血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 21(PECAM21)用來作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物是由于在發(fā)育和成熟個(gè)體的所有血管內(nèi)皮細(xì)胞都有高度表達(dá) (CD31),CD31是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的重要分子,而內(nèi)皮細(xì)胞相互間的黏附是血管生成的基本過程[10]。免疫組化染色顯示小鼠口服合歡皮提取物后對(duì)可減少接種的腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá),也就是減少內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附。具有抑制新生血管形成的作用。實(shí)驗(yàn)過程中我們選用臨床報(bào)道具有抗腫瘤作用的甘草作陰性對(duì)照,目的是為了更好的突出合歡皮抑制腫瘤生長與新生血管生成有關(guān)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,合歡皮提取物作用是多方面的,它抑制 HMEC-1內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成,降低 CD31的表達(dá),多途徑抑制新生血管的形成,從而降低腫瘤的病灶面積和抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。因此,合歡皮有可能成為一個(gè)具有較好前途的腫瘤血管形成的抑制劑。

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The Study on the Anti-angiogenen ic Effect ofA lbizia julibrissinExtracts

HUA Hui1,FENGLei1,ZHANG Xiao-ping1,ZHANGLian-fen2,J IN Jian2＊1Laboratory of NaturalM edicine,School of M edicine and Phar m aceutics,Jiangnan University;2The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

The anti-angiogenenic effect ofA lbizia julibrissinextracts was examined by the model of HMEC-1 in vitro, chick chorioallantoicmembrance and cancerin vivo.The results showed thatA lbizia julibrissinextracts could significantly inhibit the proliferation andmigration of HMEC-1 in a dose-dependentmanner(IC50=30μg/mL).It also inhibited the angiogenesis in chick chorioallantoic membrance and cancer in vivo.

A lbizia julibrissinDurazz;angiogenesis;HMEC-1

1001-6880(2010)02-0215-05

2008-05-06 接受日期:2008-08-01

2008年教育部博士點(diǎn)新教師基金(200802951021)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:jinjian31@126.com

R332;R282.71

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