藁本內(nèi)酯抑制脂質(zhì)過氧化作用的研究

龍 銳,杜俊蓉,王 蓓

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,重慶 400016;2四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥理學(xué)與生物制藥系,成都 610041

藁本內(nèi)酯抑制脂質(zhì)過氧化作用的研究

龍 銳1,2,杜俊蓉2＊,王 蓓2

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,重慶 400016;2四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥理學(xué)與生物制藥系,成都 610041

本文用維生素 E為陽性對照,探討了藁本內(nèi)酯對不同體系脂質(zhì)過氧化的抑制作用。結(jié)果顯示:5、20和80 mmol/L的藁本內(nèi)酯對亞油酸的自發(fā)氧化,VitC/Fe2+和 NADPH誘導(dǎo)的線粒體氧化,組織勻漿的自發(fā)氧化和H2O2誘導(dǎo)氧化,均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用(與空白對照組相比,P<0.05),其濃度與抗氧化活性呈一定的量效關(guān)系。藁本內(nèi)酯的體外抗脂質(zhì)過氧化作用為進(jìn)一步探討其藥理作用提供了實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

藁本內(nèi)酯;抗脂質(zhì)過氧化;維生素 E;亞油酸;線粒體

當(dāng)歸 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels)為傘形科當(dāng)歸屬植物,具有補(bǔ)血活血、潤燥滑腸、調(diào)經(jīng)止痛之功效?，F(xiàn)代研究表明,當(dāng)歸的主要成分為藁本內(nèi)酯(Ligustilide,L IG)類及其異構(gòu)物、香豆素類、黃酮類以及有機(jī)酸類[1]。藁本內(nèi)酯的藥理報(bào)道較多,但大部分是用當(dāng)歸油等含藁本內(nèi)酯的混合物來完成的,因而其藥理研究均不深入和細(xì)致。為此,我們從當(dāng)歸揮發(fā)油中提取出藁本內(nèi)酯(含量大于 98%),以維生素 E(Vitamin E,Vit E)為陽性對照,分別在純化學(xué)體系和生物體系的基礎(chǔ)上研究藁本內(nèi)酯的抗氧化作用及其劑量反應(yīng)關(guān)系,為進(jìn)一步探討其藥理作用提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

藁本內(nèi)酯由本實(shí)驗(yàn)室從當(dāng)歸中提取和純化。其化學(xué)分析結(jié)果表明:藁本內(nèi)酯含量 >98%,以二甲亞砜配成不同濃度的溶液。Vit E標(biāo)準(zhǔn)品購于上海為維他生物科技公司,還原型輔酶Ⅱ(NADPH)為 Sigma產(chǎn)品,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物

SD雄性大鼠,200～250 g,由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0進(jìn)行分析處理。結(jié)果表示為 ±s,應(yīng)用 t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較。

2 方法與結(jié)果

2.1 對亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制作用

將 3 mL亞油酸加入 3 mL吐溫-20中,漩渦振蕩混勻后加入到 200 mL的磷酸緩沖液中 (pH 7.0)制成亞油酸乳液。將 1 mL各濃度剃度的L IG或Vit E溶液加入 10 mL的乳液中,再用磷酸緩沖液定容至 25 mL?；旌先芤涸?37℃處恒溫,分別于 24,48, 72,96,120 h取出 100μL的乳液按硫氰酸鹽方法來測定脂質(zhì)氧化的程度。每 100μL乳液中加入 5 mL的 75%乙醇,0.1 mL硫氰酸銨 (30%,w/v)和 0.1 mL的氯化亞鐵。用 75%乙醇做空白,在 500nm檢測其吸光度。抑制率按下式計(jì)算:亞油酸抑制率 = (1-Ai/A0)×100%。式中 A0為空白對照組亞油酸乳液的吸光度,Ai為各濃度梯度 L IG或 Vit E乳液的吸光度。如圖 1所示:隨著時間的延長乳液在500 nm的吸光度值逐漸增大,其中空白對照組的增加趨勢更明顯,說明亞油酸自動氧化作用十分顯著。添加抗氧化劑幾個組的吸光值雖然也有上升趨勢,但上升趨勢相對較緩,說明亞油酸的氧化作用受到了抑制。各時間點(diǎn)L IG對亞油酸自發(fā)氧化都有一定的抑制作用,且呈劑量依賴性。孵育 96 h后 5,20和 80 mmol/L的 L IG對亞油酸的抑制率分別為27.1%,55.0%和 68.6%,同時陽性對照 20 mmol/L Vit E的抑制率為 41.4%。

圖 1 L IG對亞油酸自發(fā)氧化的抑制(n=3)Fig.1 Inhibition effectofL IG on linoleic acid oxidation (n=3)

2.2 對Vit C/Fe2+誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

將大鼠腦組織按照 1/9的比例用線粒體提取Buffer勻漿,勻漿液 800×g,4℃離心 10 min,上清液再 8000×g,4℃離心 20 min,沉淀即為線粒體。用考馬斯亮蘭染色法測定線粒體蛋白含量,調(diào)整各樣本的蛋白濃度均為 3 mg/mL。反應(yīng)體系中含PBS緩沖液 270μL,100μL線粒體懸液和 10μL各濃度剃度的 L IG或 Vit E溶液,在 37℃下孵育 10 min。加入 10μL 2 mmol/L抗壞血酸 (Vitamin C,Vit C)和 10μL 25μmol/L FeSO4誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。用硫代巴比妥酸法測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA):加入0.4 mL濃度為2.8%三氯醋酸終止反應(yīng),再加入 1.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸試劑,于 95℃水浴保溫 60 min,取出后立即置冷水中冷卻。加入 2 mL甲醇和正丁醇的混合溶液 (15:85),振蕩后4024×g,離心 30 min。吸取有機(jī)相 3 mL,于分光光度計(jì) 532 nm波長處比色,以空白管調(diào)零,測定吸光度值。抑制率按下式計(jì)算:抑制率 =(1-Ai/A0)× 100%。式中A0為空白對照組的吸光度,Ai為加入各濃度梯度的 L IG或 Vit E的吸光度。結(jié)果顯示, L IG能明顯抑制 Vit C/Fe2+刺激大鼠腦線粒體所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),L IG含量升高,抑制作用增強(qiáng),且呈劑量依賴性(表 1)。相同濃度的 L IG和Vit E(20 mmol/L)比較,L IG對 Vit C/Fe2+誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過氧化的抑制稍強(qiáng)于Vit E,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表 1 L IG對VitC/Fe2+誘導(dǎo)大鼠腦線粒體脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

表 1 L IG對VitC/Fe2+誘導(dǎo)大鼠腦線粒體脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

注:與空白對照組比較,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊＊P<0.001vs control group.

組別Groups濃度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – 0.094±0.004 –Vit E 20 0.075±0.002＊＊＊ 20.2±1.8 L IG 5 0.082±0.003＊＊＊ 12.8±3.5 20 0.064±0.005＊＊＊ 32.0±5.5 80 0.052±0.003＊＊＊ 47.5±3.1

表 2 L IG對NADPH誘導(dǎo)大鼠腦線粒體脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

表 2 L IG對NADPH誘導(dǎo)大鼠腦線粒體脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

注:與空白對照組比較,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001vscontrol group.

組別Groups濃度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – –Vit E 20 0.076±0.003＊＊＊ 23.2±3.3 L IG 5 0.083±0.002＊＊ 16.2±2.4 20 0.064±0.006＊＊＊ 35.4±5.9 80 0.048±0.004＊＊＊ 51.5±4.4

2.3 對NADPH誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過氧化的影響

線粒體懸液的制備同 2.2。將 10μL各濃度剃度的L IG或Vit E溶液加入 100μL的線粒體懸液中,用 PBS調(diào)整體積為380μL,37℃溫浴 10 min,加入 20μL 1 mmol/L NADPH誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化,然后再 37℃溫浴 30 min。用硫代巴比妥酸法測定并計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示,L IG能明顯抑制NADPH刺激大鼠腦線粒體所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),L IG含量升高,抑制作用增強(qiáng),且呈劑量依賴性(表 2)。相同濃度的L IG和Vit E(20 mmol/L)比較,L IG對NADPH誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用稍強(qiáng)于 Vit E,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 對大鼠腦、肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化作用的影響

健康 SD大鼠,頸椎脫臼致死,迅速分離腦、肝組織,用冰冷的生理鹽水制成 5%的勻漿。取 1.5 mL上述組織勻漿,加入 0.1 mL各濃度剃度的 L IG或Vit E溶液,對照管加 0.1 mL生理鹽水,置 37℃振蕩溫育 1.5 h。用硫代巴比妥酸法測定并計(jì)算抑制率。結(jié)果表明,L IG在 5,20,80 mmol/L的藥物濃度下,可以顯著抑制大鼠腦、肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA的生成 (與空白對照組比較,P<0. 05),且呈劑量依賴性(表 3)。

表 3 L IG對大鼠腦、肝勻漿液自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

表 3 L IG對大鼠腦、肝勻漿液自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

組別Group濃度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)腦Brain 肝Liver Vit E 20 33.2±6.0 52.9±8.1 L IG 5 38.8±11.8 47.5±8.0 20 47.8±12.8 55.7±17.0 80 58.3±11.1 63.0±18.0

表 4 L IG對 H2O2誘導(dǎo)大鼠腦、肝勻漿液脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

表 4 L IG對 H2O2誘導(dǎo)大鼠腦、肝勻漿液脂質(zhì)過氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

組別Group濃度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)腦Brain 肝Liver Vit E 20 21.0±6.4 48.4±13.2 L IG 5 40.2±13.2 50.9±7.0 20 59.5±14.0 61.6±5.9 80 66.9±10.7 65.2±4.8

2.5 對 H2O2誘導(dǎo)大鼠腦、肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用的影響

組織勻漿液的制備同 2.4。取 1.5 mL腦和肝組織勻漿液,加入 0.1 mL各濃度剃度的 L IG或 Vit E溶液,對照管加 0.1 mL生理鹽水,置 37℃振蕩溫育 30 min。加入5 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)組織勻漿的脂質(zhì)過氧化,然后再孵育 1h,用硫代巴比妥酸法測定并計(jì)算抑制率。結(jié)果表明,L IG在 5,20,80 mmol/ L的藥物濃度下,可以顯著抑制大鼠腦、肝勻漿H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成 (與空白對照組比較,P<0.05),且呈劑量依賴性(表 4)。

3 討論

脂質(zhì)過氧化物是生物膜和亞細(xì)胞膜中磷脂質(zhì)所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化形成的過氧化產(chǎn)物,它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性反應(yīng),造成多種疾病 (衰老、心血管病、炎癥、腫瘤等)[2]。因此,研究藥物有效成分的抗氧化作用對預(yù)防和治療這些疾病可能發(fā)揮重要作用。

本研究采用的五種不同的脂質(zhì)過氧化模型分別代表不同的激發(fā)體系。亞油酸自發(fā)氧化體系代表純化學(xué)反應(yīng),Vit C/Fe2+激發(fā)體系代表非酶參與微粒體生物氧化反應(yīng),NADPH激發(fā)體系代表酶參與微粒體生物氧化反應(yīng),H2O2激發(fā)體系代表組織勻漿生物氧化反應(yīng),最后一種是組織勻漿的自發(fā)氧化體系。其中,VitC與與二價金屬離子,通過 Fenton反應(yīng),生成O2-和·HO,這兩種活性氧再進(jìn)攻生物膜上的不飽和脂肪酸[3,4]。這五種脂質(zhì)過氧化模型較為全面的體現(xiàn)了在環(huán)境有害物質(zhì)的暴露條件下,人體內(nèi)發(fā)生的一系列復(fù)雜的生物膜損傷機(jī)制,從而更簡單有效地反映了藥物的生物學(xué)保護(hù)機(jī)制。

藁本內(nèi)酯經(jīng)歷了 40多年的研究,近年來隨著其研究的深人,發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯是一個很有發(fā)展前途的化合物,國外研究機(jī)構(gòu)現(xiàn)對其十分關(guān)注[5]。在本研究中,藁本內(nèi)酯對亞油酸、線粒體和組織勻漿的脂質(zhì)過氧化均有明顯抑制作用,且呈劑量依賴性,因而其全面的抗脂質(zhì)過氧化作用得到證實(shí),為其已為人知的藥用價值提供了理論依據(jù),為今后更為廣闊的應(yīng)用前景奠定了理論基礎(chǔ)。

1 HuangWH(黃偉暉),Song CQ(宋純清).Studies on the chemical constituents of Angelica sinensis.Acta Phar m Sin (藥學(xué)學(xué)報(bào)),2003,38:680-683.

2 Hal iwellB,Gutteridge JMC.Free Radicals inBiology andMedicine.New York:Oxford University Press,1985.218-313.

3 Svingen BA,Buege JA,O’Neal FO,et al.The mechanis m of NADPH-dependent lipid peroxidation.J B iol Chem,1979, 254:5892-5899.

4 Morehouse LA,Bucher JR,Tien M,et al.Effect of hydrogen peroxide microsomal lipid peroxidation.B iochem Phar m acol, 1983,2:123-127.

5 Wang CY(汪程遠(yuǎn)),Du JR(杜俊蓉),Qian Z M(錢忠明). Advances in the study of Ligustilide.Chin Phar m J(中國藥學(xué)雜志),2006,41:889-891.

Antilipoperoxidant Properties of L igustilide

LONG Rui1,2,DU Jun-rong2＊,WANGBei21The First Affiliated Hospital,Chongqing M edical University,Chongqing 400016,China;2Departm ent of phar m acology and biophar m aceutics,W est China School of phar m acy,Sichuan University,Chengdu 610041,China

This studywas conducted to investigated the antilipoperoxidant activities of ligustilide extracted fromAngelica sinensis,and vitamine E was used as the positive control.We established fivemodels:the spontaneousperoxidation of the linoleic acid emulsion,Vit C/Fe2+and NADPH induced lipid peroxidation of rat brain mitochondria,spontaneous and H2O2induced lipid peroxidation of rat tissue homogenate.L IG exhibited a significant concentration-dependant inhibition of lipid peroxidation in the linoleic acid,mitochondria and tissue homogenate.The resultsprovided experimental and theoretical basis for the research ofL IG.

ligustilide;antilipoperoxidant;vitamin E;linoleic acid;mitochondria

1001-6880(2010)02-0206-04

2009-03-30 接受日期:2009-06-05

＊通訊作者 Tel:86-23-89012401;E-mail:dujr 1@163.com

R282.71;Q949

A