擬南芥PIN2介導的生長素極性運輸調控植物根向地性*

潘建偉， 葉曉帆， 王 超, 涂世偉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

擬南芥PIN2介導的生長素極性運輸調控植物根向地性*

潘建偉， 葉曉帆， 王 超, 涂世偉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

主要觀察了擬南芥生長素輸出載體PIN2及其介導的極性運輸、生長素誘導合成對根尖生長素不對稱分布和根向地性反應的影響.結果表明：擬南芥PIN2基因突變、誘導內源生長素IAA及用抑制劑NPA或TIBA抑制生長素極性運輸都嚴重影響了根尖生長素不對稱分布的形成，最終抑制植物根向地性反應，暗示PIN2介導的生長素極性運輸和生長素不對稱分布在根向地性反應中起著關鍵性調控作用.從這些研究結果可進一步理解生長素調控植物根向地性的分子機理.

擬南芥；生長素；PIN2；極性運輸；根向地性

生長素極性運輸(polar auxin transport,PAT)在植物胚胎、側生器官的發(fā)生與發(fā)育、向性生長(tropism)中起了關鍵性的調控作用，已成為植物發(fā)育生物學領域中的研究熱點之一.生長素極性運輸由定位于細胞膜上的輸入載體AUX1/LAX家屬(auxin resistant 1/like AUX1 family)[1]和輸出載體PIN家屬(pin-formed family)[2]協(xié)同完成，其中PIN蛋白在細胞膜上的極性定位決定了生長素的極性流向[3-5].生長素不對稱分布在植物胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、向性生長過程中起著重要作用[6-9].

在擬南芥基因組中，PIN基因共有8個同源基因(PIN1-PIN8)，其中PIN1，PIN2，PIN3，PIN4，PIN5和PIN7的功能已被鑒定[3,6,7,10-13].盡管各種PIN蛋白在細胞水平上的生物學功能相同，即將生長素從胞內運到胞外或某種細胞器內，但這種功能卻具有組織和器官特異性.PIN1主要在器官發(fā)生和維管組織分化中起作用[3]，PIN2主要在植物根向地性(gravitropism)生長中起作用[10]，PIN3主要在莖和根的向性生長中起作用[6]，PIN4主要在根尖分生組織中起作用[11]，PIN5主要在維持胞內生長素穩(wěn)態(tài)中起作用[13]，PIN7主要在早期胚胎發(fā)育中起作用[7].

植物根系向地性是決定根系空間生長趨勢的主要因素之一，對于植物養(yǎng)分吸收(尤其是磷的吸收)具有重要影響[14].因此，深入研究植物根系向地性的分子機理對作物根系遺傳改良具有理論和實驗指導意義.本研究主要觀察了擬南芥野生型根尖受到重力刺激后，PIN2和生長素在根尖的分布；pin2突變對根尖生長素分布及向地性的影響；根尖內源生長素誘導對生長素的分布及向地性反應的影響；抑制生長素極性運輸對生長素的分布及向地性的影響.弄清這些問題對進一步理解生長素調控植物根向地性的分子機理具有重要意義.

1 材料與方法

1.1實驗材料與生長條件

本研究中所用擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型為Col-0(Columbia-0)，表達載體PIN2∶∶PIN2∶GFP[15],WOX5∶∶IAAH[16],DR5∶∶GFP[12]分別由Ben Scheres和Jiri Friml等實驗室提供，pin2突變體(T-DNA插入突變體)購自美國俄亥俄州立大學擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC).生長素極性運輸抑制劑NPA(N-1-naphthylphthalamic acid),TIBA(2,3,5-triiodobenzoic acid)和生長素前體物質IAM(indole-3-acetamide)均購自Sigma公司，配制方法參考文獻[17].

擬南芥種子經表面消毒后，在4 ℃黑暗處理3 d，然后在含1.5%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基(Sigma公司)表面上萌發(fā)，培養(yǎng)皿豎直放置,生長條件為:24 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗,70%～80%相對濕度和6 000 lx光照強度.萌發(fā)5 d后的根用于本研究的所有實驗.

1.2激光共聚焦分析

本研究中使用的激光共聚焦顯微鏡型號為Leica TCS SP5 AOBS，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為510 nm，所有實驗均在相同設置下完成，并獨立重復3次.用Image J軟件對質膜上極性定位的PIN2-GFP進行定量分析.

1.3根尖向地性測定

將長有20株5 d幼苗的培養(yǎng)皿旋轉90°，進行重力刺激2 h，然后用數(shù)碼相機拍照，再用Image J軟件測量根尖向重力方向彎曲的角度.所有實驗均獨立重復3次.對于化學試劑處理實驗，在重力刺激前，小心地將幼苗轉移到分別含有1 μmol/L IAM,10 μmol/L NPA,10 μmol/L TIBA的1/2 MS培養(yǎng)基表面上，先豎直預處理2 h，然后再旋轉90°重力刺激2 h，再進行拍照與測量.

2 結 果

2.1根尖PIN2極性定位與不對稱分布誘導植物根向地性反應

擬南芥PIN2基因突變使根失去向地性反應(見圖1中A和B)，暗示PIN2在根向地性反應中具有重要功能.利用PIN2∶∶PIN2∶GFP表達載體[15]可進一步分析PIN2基因的表達區(qū)域、PIN2蛋白亞細胞定位及重力刺激對PIN2蛋白的影響.如圖1中C和D所示，擬南芥PIN2基因主要在根尖表皮細胞和皮層細胞中表達，PIN2∶GFP融合蛋白極性定位于表皮細胞頂端質膜上、幼嫩皮層細胞下端質膜上、成熟皮層細胞頂端質膜上(圖1中未顯示成熟皮層細胞).當重力刺激(即根處于水平方向)2 h，PIN2∶GFP融合蛋白在根尖上、下兩側呈不對稱分布(上少下多)(見圖2中A和B).進一步的定量分析表明，在無重力刺激下(即根處于豎直向下的方向)，根尖左、右兩側的PIN2∶GFP水平無顯著性差異(t-檢驗,Pgt;0.05)，而在2 h的重力刺激下，根尖上、下兩側的PIN2∶GFP水平存在極顯著性差異(t-檢驗,Plt;0.01)(見圖2中C).這一結果暗示根尖PIN2不對稱分布很可能誘導了根向地性反應.

A—萌發(fā)5 d的野生型Col-0；B—萌發(fā)5 d的pin2突變體；C—PIN2∶∶PIN2∶GFP Col-0根尖結構及其PIN2∶GFP亞細胞定位 D—圖C中虛線框內的放大圖.表示重力方向；▽表示PIN2∶GFP融合蛋白在表皮細胞和皮層細胞中的極性定位1—根尖側根冠細胞;2—表皮細胞;3—皮層細胞;4—內皮層細胞;5—中柱細胞;6—根冠細胞;7—靜止中心;8—分生組織圖1 擬南芥根向地性反應與根尖PIN2極性定位

A—在無重力刺激下，PIN2∶GFP在根尖左、右的分布；B—重力刺激2 h，PIN2∶GFP在根尖上、下的不對稱分布 C—圖A和B中PIN2∶GFP在根尖左、右或上、下的相對水平.表示重力方向；**表示有極顯著性差異(t-檢驗,Plt;0.01)圖2 重力刺激對根尖PIN2分布的影響

2.2PIN2介導根尖生長素不對稱分布

為進一步揭示PIN2誘導根向地性反應的機理，對根尖生長素分布進行了測定.由于DR5是一個生長素反應的強啟動子，利用DR5∶∶GFP表達載體可間接反映生長素在某一組織或器官中的水平與分布[12].如圖3中A和B所示，在無重力刺激下，GFP在根冠細胞、側根冠細胞、靜止中心、根尖分生組織、中柱細胞等均有較強的表達，但在根尖左、右兩側的表皮細胞中并沒有明顯的表達，表明:根尖在豎直生長過程中，生長素在前述組織中均有大量積累，而在根尖表皮細胞中沒有明顯的積累.在2 h重力刺激下，GFP除了在上述提到的區(qū)域表達外，在根尖下側表皮細胞中也有較強的表達，而在根尖上側沒有明顯的表達，這反映了生長素在根尖下側比上側多.這一結果表明:在根尖向地性反應過程中，生長素在根尖上、下兩側的分布是不對稱的.

A—DR5∶∶GFP Col-0，無重力刺激；B—DR5∶∶GFP Col-0，重力刺激2 h；C—DR5∶∶GFP pin2，無重力刺激D—DR5∶∶GFP pin2，重力刺激2 h；E—DR5∶∶GFP WOX5∶∶IAAH，無IAM處理但重力刺激2 hF—DR5∶∶GFP WOX5∶∶IAAH，先1 μmol/L IAM處理2 h，再重力刺激2 hG—DR5∶∶GFP Col-0，先10 μmol/L NPA處理2 h，再重力刺激2 hH—DR5∶∶GFP Col-0，先10 μmol/L TIBA處理2 h，再重力刺激2 h表示重力方向；▽表示生長素在根尖兩側的分布圖3 pin2,生長素合成及其運輸對根尖生長素不對稱分布的影響

為弄清PIN2在誘導生長素不對稱分布中是否起調控作用，進一步觀察了pin2突變體根尖生長素的分布情況.如圖3中C和D所示，不管有無重力刺激，GFP在根尖上、下兩側均有較強的表達，說明pin2突變后根尖生長素的不對稱分布消失.這些證據(jù)充分表明:PIN2對根尖生長素不對稱分布具有重要調控作用.

2.3誘導內源生長素和抑制極性運輸對根尖生長素分布的影響

在根尖重力刺激前，外源生長素的處理將使根尖生長素失去不對稱分布(圖略).然而，內源生長素過量合成是否也同樣會導致根尖生長素不對稱的消失?利用WOX5∶∶IAAH[16]和DR5∶∶GFP[12]2個表達載體可回答這一問題.WOX5是一個根尖靜止中心特異性表達啟動子，IAAH是吲哚乙酰胺水解酶(indole-3-acetamide hydrolase，IAAH)基因，IAAH能水解IAA前體吲哚乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)而釋放出吲哚乙酸IAA.因此，IAM處理后，WOX5∶∶IAAH能在根尖靜止中心源源不斷地釋放出游離的IAA，以模擬根尖內源生長素流.如圖3中E和F所示，無IAM處理但重力刺激2 h后，GFP表達與圖3中B完全一致，均在根尖下側表達；而先用IAM處理、再重力刺激2 h后，GFP在根尖上、下兩側均有表達，與圖3中D相似.這一結果表明內源生長素過量誘導將導致根尖生長素不對稱分布的消失，同時也暗示內源生長素生物合成途徑的精確調控對生長素介導的根向地性具有重要意義.

已有的研究暗示PIN2的主要功能是介導根尖生長素的極性運輸[10,18]，但仍然不清楚抑制或破壞生長素的極性運輸是否會影響生長素不對稱分布.利用已知生長素極性運輸抑制劑NPA(N-1-naphthylphthalamic acid)和TIBA(2,3,5-triiodobenzoic acid)能證實這一點.如圖3中G和H所示，先用NPA或TIBA預處理,再用重力刺激2 h后，GFP在根尖上、下兩側均有表達，表明抑制極性運輸將導致根尖生長素不對稱分布的消失.因此，以上證據(jù)進一步支持PIN2的不對稱分布及其介導的生長素極性運輸是根尖生長素不對稱分布的主要原因.

2.4PIN2介導的生長素不對稱分布誘導植物根向地性反應

為證實PIN2介導的生長素極性運輸、根尖生長素的不對稱分布是否在根向地性反應中起作用，在上述相同實驗條件下進一步測定了根向地性反應.如圖4所示，與正常對照相比，pin2突變、內源生長素的過量誘導、生長素極性運輸抑制劑NPA和TIBA均顯著性地抑制了根向地性的反應(t-檢驗,Plt;0.05或0.01).以上結果充分證實PIN2介導的極性運輸通過生長素的不對稱分布來調控植物根向地性反應，暗示PIN2介導的生長素不對稱分布是誘導植物根向地性反應的必要條件.

不同字母之間表示有顯著或極顯著性差異(t-檢驗,Plt;0.05或0.01)圖4 pin2,生長素合成及其運輸對植物根向地性反應的影響

3 討 論

本研究結果表明:在根向地性反應過程中，PIN2蛋白在根尖上、下兩側呈不對稱分布，從而誘導了生長素的不對稱分布.然而，重力如何誘導PIN2在根尖上、下兩側呈不對稱分布？近幾年的研究表明:當根受到重力刺激后，在根冠細胞表達的PIN3亞細胞定位由原先無極性分布快速(幾min內)轉變成極性分布(靠重力方向的細胞膜)，導致更多的生長素流向根尖下側面[6].筆者最近的研究表明:更多的生長素流向根尖下側細胞將誘導更多的PIN2表達并極性定位于細胞頂端質膜上[17]，而根尖上側面由于生長素的減少使質膜上極性定位的PIN2隨之減少[19]，最終導致根尖上、下兩側PIN2呈不對稱分布(上少、下多).文獻[17]利用遺傳學、細胞學等方法進一步發(fā)現(xiàn)了在生長素受體突變背景下(即生長素信號傳導途徑受阻)，生長素未能誘導PIN2在根尖上、下兩側的不對稱分布，表明生長素通過其信號傳導途徑調控PIN2的不對稱分布.

從上述分析與本研究結果可以得出：對于根向地性反應來說，生長素生物合成、生長素極性運輸和生長素信號傳導三者之間缺一不可，并通過相互之間的正、反調控來精確地控制根向地性反應,只要其中一個過程受到影響，必將影響根尖向地性的正常反應.生長素在幼嫩組織中合成后，由PIN蛋白將其運輸?shù)桨l(fā)揮作用的特定位點，然后通過其信號傳導途徑對相應的組織或器官的發(fā)育或向性生長進行調控.具體地說，當PIN2將生長素運輸?shù)礁庀聜壬扉L區(qū)時，生長素通過其信號傳導途徑抑制根尖下側伸長區(qū)細胞的伸長，最終由于根尖上側細胞伸長比下側細胞快而引起根尖向下彎曲生長.

值得一提的是,本研究過程中發(fā)現(xiàn)pin2突變體根尖上、下兩側均有生長素的梯度分布，而Abas等[9]的觀察表明eirl-4/pin2突變體根尖上、下兩側均沒有生長素分布與積累，這可能起因于兩家實驗室的實驗條件不一致，尤其是生長條件的不同將造成植物根尖生長素積累水平的不同，從而引起生長素分布模式不同.但有一點可以肯定，受重力刺激的pin2突變體中，根尖生長素分布不會出現(xiàn)明顯的不對稱分布.

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(責任編輯 薛 榮)

PIN2-mediatedpolarauxintransportregulationofrootgravitropisminArabidopsisthaliana

PAN Jianwei, YE Xiaofan, WANG Chao, TU Shiwei

(CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

Auxin efflux carrier PIN2, PIN2-mediated polar auxin transport (PAT) and induced auxin synthesis effects on auxin nonsymmetric distribution and gravity response were examined inArabidopsisroots. It was showed that mutatedpin2, endogenously induced IAA and inhibition of PAT with NPA or TIBA severely impaired auxin nonsymmetric distribution and in turn inhibited root gravity response, indicated that PIN2-mediated PAT could regulate root gravity response through modulating auxin nonsymmetric distribution in the root tip. These findings would be helpful to understand the molecular mechanisms underlying auxin regulation of root gravitropism in plants.

Arabidopsisthaliana; auxin; PIN2; polar auxin transport; root gravitropism

1001-5051(2010)01-0001-06

2009-12-23

國家自然科學基金資助項目(30970255)；國家科技重大研究專項(2009ZX08009-076B)

潘建偉(1969-)，男，浙江紹興人，校特聘教授，博士．研究方向：植物發(fā)育遺傳學．

Q945.7

A