5-羥色胺2A受體阻滯劑保護(hù)糖尿病大鼠陰莖勃起功能作用的研究△

寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(銀川 750004)

陳 凌 何蘭杰★ 李國(guó)徽*

勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)是糖尿病常見并發(fā)癥(DED),其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,也缺乏有效的防治措施。血管因素在 DED形成過(guò)程中起著重要的作用,主要包括由舒縮血管因子比例失衡引起的血管舒縮活動(dòng)紊亂及血管系統(tǒng)的病理?yè)p傷。5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)是一種具有多種功能的神經(jīng)介質(zhì)和血管活性物質(zhì),通過(guò)作用于血小板和血管內(nèi) 2A型受體(5-HT2AR)參與了包括血小板聚集、活化、血栓形成、血管收縮等病理過(guò)程。已知糖尿病病人血清 5-HT濃度明顯增高,其通過(guò) 5-HT2AR收縮血管的效應(yīng)顯著增強(qiáng)。此外,5-HT及其 2A型受體在血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌增生及遷移、動(dòng)脈粥樣硬化等過(guò)程中起重要作用,認(rèn)為5-HT及其 2A型受體與糖尿病血管功能紊亂及組織病變關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察 5-HT2A受體阻滯劑對(duì)糖尿病大鼠陰莖 eNOS表達(dá)水平及血清 NO、ET-1、5-HT的含量、陰莖組織病變的影響,探討 5-HT及其 2A型受體參與DED發(fā)病的機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 試劑:鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):美國(guó) sigma公司。鹽酸沙格雷酯(Sarpogrelate hydrochloride安布樂(lè)克):日本三菱制藥株式會(huì)社,生產(chǎn)批號(hào):HG01。枸櫞酸西地那非(Sildenafil citrate萬(wàn)艾可):輝瑞制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào):55883002。阿樸嗎啡(APO):美國(guó) Sigma公司。血清 5-HT、ET-1 ELISA檢測(cè)試劑盒,大連范邦生物科技有限公司 。血清 NO檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程有限公司。免疫組織化學(xué) SP試劑盒:DAB顯色液、兔抗大鼠 eNOS抗體(工作濃度 1∶100):武漢博士德生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:2月齡雄性 SD大鼠 70只,體重(245±25)g(寧夏醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng) 1周,APO試驗(yàn)陽(yáng)性后,隨機(jī)分為常規(guī)飼料喂養(yǎng)組(A組 n=10),高脂高糖喂養(yǎng)組(B組n=60)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

2 方 法

2.1 糖尿病模型建立:B組大鼠高脂高糖喂養(yǎng) 8周后腹腔注射STZ 35mg/kg。A組大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng),注射相同數(shù)量枸櫞酸緩沖液。注射 STZ 72h后,強(qiáng)生微量血糖儀檢測(cè)尾尖血糖,以血糖≥11.1mmol/L并持續(xù) 3d作為糖尿病動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)。將成模大鼠隨機(jī)分成三組:糖尿病組 25只(DM)、鹽酸沙格雷酯干預(yù)組 14只(SH)、西地那非組14只(WG)。A組大鼠作為正常對(duì)照組(NC)。SH組大鼠給予鹽酸沙格雷酯100mg/(kg· d)灌胃,共12周;WG組大鼠在進(jìn)行APO誘導(dǎo)陰莖勃起實(shí)驗(yàn)前 3d給予西地那非20mg/(kg· d)灌胃;NC與DM組給予等量飲用水灌胃。全部大鼠于灌胃后第 12周處死。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 一般項(xiàng)目:觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)、毛色、飲食狀況,每 4周稱量體重1次,并測(cè)量尾尖血糖。

2.2.2 陰莖勃起試驗(yàn):在第 0、4、8、12周進(jìn)行APO誘導(dǎo)陰莖勃起試驗(yàn),參考 Heaton等皮下注射APO的方法[1]。大鼠置于安靜且光線暗的環(huán)境中,稱重后,每只大鼠在頸部皮下注射 APO,劑量為80μg/kg。陰莖頭露出,包皮后退,陰莖膨大為陰莖勃起 1次,視為APO實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。每只大鼠觀察 30min記錄,陰莖勃起次數(shù)和勃起率,以陰莖無(wú)勃起為判斷 ED標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 血清 NO檢測(cè):硝酸還原酶法測(cè)定,按試劑盒說(shuō)明操作。

2.2.4 血清胰島素 5-羥色胺(5-HT)、內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA檢測(cè),按試劑盒說(shuō)明操作。

2.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè):采用 SP法,嚴(yán)格按說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,以已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。以 DAB顯色,蘇木素復(fù)染。顯色結(jié)果在高倍鏡下根據(jù)染色區(qū)變化和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析:0分,無(wú)陽(yáng)性染色染色(染色面積 0～25%);1分,輕度陽(yáng)性(染色面積 26%～50%);2分,中度陽(yáng)性(染色面積 51%～75%);4分,重度陽(yáng)性(染色面積 76%～100%)。

2.2.6 常規(guī) HE染色及H-600透射電鏡觀察形態(tài):完整切取陰莖海綿體組織,剪去包皮及軟骨,橫切一小段立即浸入10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備4μm厚的切片;另切一段陰莖組織,低溫下細(xì)切為1mm×1mm×1mm小塊,置于含 4%戊二醛中前固定,留于透射電鏡檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,各組數(shù)據(jù)采用 ANOVA方差分析,同時(shí)行多樣本均數(shù)間的兩兩比較,免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 一般情況及生化變化:未成模大鼠 7只,有19只大鼠在注射 STZ后不同時(shí)期死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),NC組 10只,DM組 18只,SH組 8只,WG組 8只。糖尿病大鼠均出現(xiàn)典型“三多一少”癥狀,毛發(fā)枯黃無(wú)光澤,部分大鼠出現(xiàn)爛尾、肢體感染和潰瘍等合并癥。12周時(shí) DM、SH、WG組血糖水平較 NC組明顯升高(P＜0.01)。與DM組相比,鹽酸沙格雷酯干預(yù)治療未改善糖尿病大鼠的多飲、多尿、多食、體重減輕的癥狀。SH組血糖水平較 SL、DM、WG組有所下降,但各組之間血糖無(wú)顯著差異,見表1。

2 大鼠陰莖勃起功能 APO實(shí)驗(yàn)測(cè)定:DM組陰莖勃起率、勃起次數(shù)隨糖尿病病程延長(zhǎng)呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)。與NC組相比,DM組大鼠各期勃起次數(shù)均明顯低于NC組 P＜0.01),兩組比較 8周時(shí) P＜0.05,12周時(shí) P＜0.01。WG組為陽(yáng)性對(duì)照組,西地那非干預(yù)能顯著改善大鼠勃起功能,與DM組相比,WG組各期勃起次數(shù)及勃起率有不同程度上升,其中 4、8周勃起次數(shù)比較 P＜0.01,WG組各期勃起率均高于同期 DM組水平,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與DM組相比,SH組各期勃起率及勃起次數(shù)均高于同期 DM組相應(yīng)指標(biāo)水平,8周時(shí)勃起次數(shù)比較 P＜0.05。與WG組比較,4周時(shí)SH組勃起率及勃起次數(shù)均低于WG組(P＜0.05),8周時(shí) SH上述指標(biāo)與WG組接近(P＞0.05),12周時(shí)SH組勃起率均高于WG組,同期勃起次數(shù) SH組高于WG組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表2。

3 干預(yù)治療對(duì)血清 NO、ET-1、5-HT及NO/ET-1的影響:12周病程 DM組大鼠血清 NO濃度顯著下降,5-HT、ET-1明顯升高,NO/ET-1比值顯著下降,與NC組相比 P均＜0.01。WG組上述指標(biāo)與DM組比較無(wú)明顯差異。與DM組相比,SH組血清 NO濃度、NO/ET-1比值上升,血清 ET-1、5-HT水平下降,NO濃度比較 P＜0.05,NO/ET-1、5-HT比較 P＜0.01,ET-1比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表3。

表1 各組大鼠血糖、體重比較

表2 各組大鼠陰莖勃起次數(shù)和勃起率情況

表3 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

圖1 各組 eNOS免疫組化染色結(jié)果對(duì)比觀察(HE×400)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

4 免疫組織化學(xué)結(jié)果:正常大鼠陰莖 eNOS表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,陽(yáng)性顯色為褐色。實(shí)驗(yàn) 12周末,半定量分析結(jié)果表明,DM組大鼠陰莖海綿體eNOS陽(yáng)性染色強(qiáng)度顯著減弱,染色面積減少(P＜0.01)。鹽酸沙格雷酯治療后 eNOS表達(dá)較 DM組明顯上調(diào)(P＜0.01),見表4,圖1。

5 陰莖海綿體病理改變光鏡、電鏡下觀察結(jié)果:HE染色,光鏡下觀察。NC組:血竇分布均勻、神經(jīng)組織及血管腔結(jié)構(gòu),血竇內(nèi)少見血小板,間質(zhì)組織無(wú)增生。WG、DM組:血竇分布雜亂,間質(zhì)組織增生明顯,血竇腔狹窄、閉塞,內(nèi)可見大量血小板成分。SH組:血竇分布均勻,竇腔狹窄程度較 DM組明顯減輕,內(nèi)少見血小板成分,間質(zhì)組織增生不明顯,海綿體組織結(jié)構(gòu)基本完整,見圖2。

表4 各組陰莖海綿體 eNOS免疫組化檢測(cè)半定量分析結(jié)果

圖2 各組陰莖海綿體病理結(jié)構(gòu)對(duì)比觀察(HE×400)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

圖3 陰莖海綿體超微結(jié)構(gòu)對(duì)比觀察(×5000)(A:正常組,B:糖尿病組,C:鹽酸沙格雷酯高劑量組)

電鏡觀察顯示,NC組:血竇內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜完整,胞漿豐富,可見多量質(zhì)膜小泡,胞核型態(tài)正常;間質(zhì)組織散在分布其中。DM組、WG組:血竇內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯,胞質(zhì)濃集,其內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等細(xì)胞器亦明顯減少,少見質(zhì)膜小泡,染色質(zhì)邊集或聚集成塊;增生內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)肥大,程多邊形,相互擁擠于血竇腔內(nèi),血竇腔被部分或全部堵塞;間質(zhì)組織增生明顯,成纖維細(xì)胞增生,型態(tài)異常,染色質(zhì)凝集現(xiàn)象明顯,膠原大量堆積,排列密集。SH組:損傷較 DM組明顯減輕,海綿竇組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)近于正常,內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯增生,胞漿豐富,內(nèi)可見較多質(zhì)膜小泡,染色質(zhì)無(wú)明顯聚集現(xiàn)象,膠原無(wú)明顯增生現(xiàn)象,見圖3。

討 論

血管舒縮動(dòng)態(tài)平衡的正常調(diào)解是陰莖勃起的關(guān)鍵,任何損害或干擾這一調(diào)節(jié)過(guò)程的因素均會(huì)導(dǎo)致陰莖海綿體血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變異,直接誘發(fā) ED。5-HT是重要血管活性物質(zhì),它通過(guò) 5-HT2A受體發(fā)揮收縮血管的效應(yīng)[2]。糖尿病時(shí) 5-HT的血清濃度明顯增高,這在以往及本研究中得到證實(shí)。糖尿病增高的血清 5-HT主要是由過(guò)度活化的血小板釋放而來(lái)[3]。此時(shí),5-HT通過(guò)其 2A型受體收縮血管的效應(yīng)明顯增強(qiáng)[4]。實(shí)驗(yàn)中 SH組 DM大鼠血清 5-HT明顯下降,說(shuō)明 5-HT2A受體阻滯劑可有效抑制糖尿病時(shí)血小板的過(guò)度活化,這一變化勢(shì)必減弱其收縮血管效應(yīng)的發(fā)揮,同時(shí)抑制由于血小板過(guò)度活化和脫顆粒造成的血栓形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及進(jìn)一步血管病變的發(fā)生,這些均有助于阻止 DED的發(fā)生和發(fā)展。此外,5-HT2A受體阻滯劑阻斷血管上 5-HT2A型受體,從而抑制 5-HT的縮血管作用,進(jìn)一步校正糖尿病時(shí)血管舒縮平衡紊亂,改善 DED病情。值得注意的是,5-HT2A受體阻滯劑不僅可以減少作為縮血管物質(zhì)—5-HT本身的釋放,同時(shí)可以阻斷其收縮血管效應(yīng)發(fā)揮的媒介-5-HT2A受體,達(dá)到最大抑制血管收縮效應(yīng),這是其它受體阻滯劑所沒(méi)有的特點(diǎn)。

NO在調(diào)解陰莖血流量方面起重要作用,其濃度及功能的變化所導(dǎo)致的血管舒縮失衡是 DED的重要發(fā)病機(jī)制之一[5,6]。陰莖組織中的NO是由 nNOS和eNOS兩個(gè)酶系所激發(fā),大量研究表明,eNOS在陰莖勃起過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[6～8]。糖尿病導(dǎo)致 NO合成減少,eNOS表達(dá)下降是其主要原因之一。許多研究表明伴隨糖尿病模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物勃起功能的下降,陰莖海綿體內(nèi) eNOS蛋白及基因表達(dá)均明顯下調(diào),海綿體 NO濃度也相應(yīng)下降[9,10]。本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致,說(shuō)明糖尿病導(dǎo)致陰莖海綿體 eNOS表達(dá)下調(diào)進(jìn)而引起的NO分泌減少是 DED發(fā)病機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)中5-HT2A受體阻滯劑干預(yù)后海綿體 eNOS表達(dá)較 DM組明顯上調(diào),血清 NO含量較 DM組升高,大鼠陰莖勃起功能有不同程度的改善。這一結(jié)果說(shuō)明,5-HT2A受體阻滯劑保護(hù)糖尿病大鼠陰莖勃起功能的另一途徑是上調(diào)海綿體 eNOS的表達(dá),增加 NO的分泌,糾正血管舒縮因子平衡紊亂,促進(jìn)血管擴(kuò)張和海綿體充血。實(shí)驗(yàn)提示 5-HT收縮血管的另一機(jī)制可能是抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)。

在正常生理?xiàng)l件下,由于5-HT血清濃度較低,加之眾多血管活性因子相互作用的協(xié)調(diào),5-HT及其 2A型受體收縮血管的效應(yīng)在機(jī)體正常調(diào)節(jié)下維持適當(dāng)?shù)乃?但糖尿病時(shí)增高的血清 5-HT對(duì)血管的收縮效應(yīng)可能被大大擴(kuò)增,特別是在可以拮抗其作用的舒血管物質(zhì)(NO)同時(shí)減少或活性降低的情況下就更為嚴(yán)重。從這一意義上來(lái)說(shuō),糖尿病時(shí)由 5-HT及其 2A受體引起的血管收縮效應(yīng)的增強(qiáng)而導(dǎo)致的血管舒縮平衡紊亂在 DED發(fā)病中所起到的作用可以不亞于由于NO合成減少及活性降低對(duì) DED發(fā)病的貢獻(xiàn)作用。5-HT2A受體阻滯劑可以改善糖尿病大鼠勃起功能的結(jié)果表明,縮血管作用的增強(qiáng)是 DED發(fā)病的重要原因之一,單純?cè)黾邮嫜芪镔|(zhì)的療法對(duì)于DED是不全面的。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管張力的調(diào)節(jié)中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙是導(dǎo)致血管功能紊亂、組織病理改變的基礎(chǔ)[11]。糖尿病導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷,主要表現(xiàn)為對(duì)舒血管物質(zhì)反應(yīng)的減弱和對(duì)縮血管物質(zhì)的高敏感性,同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的舒縮血管活性物質(zhì)之間的比例失衡[12]。上述改變阻礙陰莖勃起時(shí)血管的舒張和海綿體充血,導(dǎo)致 DED的發(fā)生。隨著糖尿病病程的進(jìn)展,內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)一步發(fā)展,使其抗凝、纖溶和血管活性物質(zhì)代謝以及調(diào)節(jié)血管張力等功能障礙或喪失,導(dǎo)致血栓形成、血管阻賽、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展,這些病理改變都是 EDE的發(fā)病機(jī)制之一。組織病理學(xué)觀察結(jié)果及血清 NO、NO/ET-1變化情況表明鹽酸沙格雷酯有顯著保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。5-HT2A受體阻滯劑治療 DED的另一途徑是保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,阻止內(nèi)皮細(xì)胞增生、損傷,從而延緩、阻止進(jìn)一步嚴(yán)重血管系統(tǒng)病變的發(fā)生。另外,此作用可能是 5-HT2A受體阻滯劑上調(diào) eNOS表達(dá)的機(jī)制之一。

經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比觀察可以得出結(jié)論,5-HT2A受體阻滯劑保護(hù) DM大鼠陰莖勃起功能的機(jī)制不同于西地那非。西地那非藥效的機(jī)制是在需要時(shí)短期內(nèi)增強(qiáng)舒血管物質(zhì) NO的生理效應(yīng),從而達(dá)到促進(jìn)陰莖勃起的作用。這一機(jī)制對(duì)于NO合成顯著下降的DM患者而言,療效難以發(fā)揮,且經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)西地那非對(duì)糖尿病陰莖組織病變無(wú)顯著影響。據(jù)此推測(cè),對(duì)已存在組織病變的患者其療效非常有限。而 5-HT2A受體阻滯劑在糾正血管舒縮平衡紊亂的同時(shí),對(duì)糖尿病陰莖組織病理?yè)p傷有明顯的改善作用,這也是其保護(hù)陰莖勃起功能顯效較晚的主要原因。雖然 5-HT2A受體阻滯劑在短時(shí)間內(nèi)增加舒血管效應(yīng)的作用低于西地那非,所以在 DM早期其改善勃起功能的作用有限,但隨 DM病情的進(jìn)展,該藥改善糖尿病大鼠陰莖組織病理?yè)p傷狀況的作用凸現(xiàn),此時(shí)其作用逐漸顯現(xiàn)。

綜上所述,5-HT2A受體阻滯劑對(duì)糖尿病大鼠陰莖勃起功能有保護(hù)作用,它能使陰莖 eNOS表達(dá)上調(diào),血清 NO濃度、NO/ET-1比值上升,改善糖尿病大鼠陰莖組織病理?yè)p傷狀況,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,抑制膠原增生。結(jié)合 5-HT、5-HT2A受體在糖尿病大鼠海綿體表達(dá)的變化情況,可以得出結(jié)論5-HT及5-HT2A受體在 DED的發(fā)生中起重要作用,5-HT2A受體阻滯劑可能成為防治 DED的另一條途徑。

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