豬流行性腹瀉疫苗的研究

陳建飛，馮 力，時(shí)洪艷，崔尚金

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由尼多目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）α-冠狀病毒中的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic d iarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種急性、高度傳染性的腸道疾病，該病以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征。各種日齡的豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為30%～80%。

PED 于1971 年首次在英格蘭的架子豬和育肥豬群中暴發(fā)；1978 年在比利時(shí)和英國(guó)流行性腹瀉發(fā)作期間，該病被證實(shí)是由PEDV 引起的[1]。到目前為止，歐洲和亞洲的許多養(yǎng)豬國(guó)家都有該病的報(bào)道[2]，而北美和南美至今還未見該病的報(bào)道。1973 年，類豬傳染性胃腸炎的急性腹瀉首先在我國(guó)上海發(fā)生，但是直到1984 年，才經(jīng)熒光抗體試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)證實(shí)該病的病原是PEDV[3]。到目前為止，我國(guó)已有24 個(gè)省報(bào)道了PED 的發(fā)生和流行情況。PED 主要發(fā)生在冬春季節(jié)，病毒主要通過感染豬的糞便而傳播，自然感染病例大多是經(jīng)口攝入而感染，糞——口途徑是該病的主要傳播途徑。隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，給該病的傳播創(chuàng)造了有利條件。目前，疫苗接種是預(yù)防和控制該病的有效手段?，F(xiàn)結(jié)合本課題組的研究進(jìn)展及國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展，回顧總結(jié)一下PED 疫苗的研究情況。

1 PED組織滅活苗

1993 年本課題組的王明研究員等[4]將經(jīng)接種仔豬、免疫熒光檢查及與PED CV777 毒株對(duì)比試驗(yàn)證實(shí)為PEDV 的滬毒株（S 株）接種3～9 日齡仔豬，待典型發(fā)病后迫殺，采集小腸組織及內(nèi)容物，制備PED 氫氧化鋁滅活苗，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外無PED疫苗的空白。該疫苗經(jīng)后海穴注射，對(duì)仔豬的主動(dòng)保護(hù)率為85%，被動(dòng)保護(hù)率為97.06%。接種后2 周開始產(chǎn)生免疫力，免疫期可達(dá)6 個(gè)月。

2 PED細(xì)胞滅活苗

由于組織滅活苗存在操作繁瑣、生產(chǎn)成本高及質(zhì)量難以控制等缺點(diǎn)，本課題組馬思奇研究員等[5]采用在病毒培養(yǎng)液中加適量胰酶的培養(yǎng)方法，將PEDV CV777 適應(yīng)于Vero 細(xì)胞，以28代毒制備氫氧化鋁滅活苗，后海穴接種，對(duì)仔豬的主動(dòng)免疫保護(hù)率為85.19%，被動(dòng)免疫保護(hù)率為85%。通過該方法制備的PED 細(xì)胞滅活苗可用于現(xiàn)地PEDV 的預(yù)防與控制。

3 PED弱毒苗

雖然滅活疫苗具有安全、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)由于滅活疫苗具有需要大劑量接種或者應(yīng)用濃縮抗原；免疫期短，常需強(qiáng)化接種；不能引起局部免疫，以致細(xì)胞免疫的作用弱；產(chǎn)生完全免疫力需要2 周；不利于緊急預(yù)防接種與降低疫苗費(fèi)用等缺點(diǎn)，促進(jìn)了PED 弱毒疫苗的研制。目前，PED 的商品化弱毒疫苗主要有我國(guó)的CV777 株，日本的P-5V 株和韓國(guó)的KPED-9 株、DR13株。本課題組的佟有恩研究員等[6]將適應(yīng)Vero 細(xì)胞的CV777 株從90 代起進(jìn)行克隆純化，目的是穩(wěn)定減弱的毒力并保持良好的免疫原性。克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主動(dòng)免疫與被動(dòng)免疫的保護(hù)率分別達(dá)到95.92%及96.2%。穩(wěn)定性試驗(yàn)經(jīng)6 代次的返祖?zhèn)鞔允欠€(wěn)定的，未見毒力返強(qiáng)，證明此弱毒株已培育成功，符合弱毒疫苗毒株的條件。日本的P-5V 株雖然沒有連續(xù)傳代致弱的相關(guān)報(bào)道，卻在日本和韓國(guó)用于PED 的預(yù)防。韓國(guó)的KPED-9 是由從新生仔豬分離的KPEDV-9 通過Vero 細(xì)胞連續(xù)傳代93 代后制備而成的；DR13 是由從患病仔豬小腸內(nèi)容物分離的DR13 強(qiáng)毒通過Vero 細(xì)胞連續(xù)傳代而成，該疫苗是韓國(guó)用于預(yù)防PED 的口服疫苗。

3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

在病毒性腹瀉的免疫機(jī)制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。腸道黏膜分泌的IgA 抗體能抵御入侵的病原體。口服疫苗能刺激黏膜免疫，并能產(chǎn)生黏膜和血清保護(hù)性IgA 抗體，是預(yù)防腸道傳染病的有效途徑。轉(zhuǎn)基因植物作為口服疫苗有可能產(chǎn)生理想的黏膜免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防病毒性腹瀉病的目的。2003 年，韓國(guó)Bae 等將PEDV 中和表位區(qū)域COE 基因轉(zhuǎn)入到煙草，構(gòu)建了表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因煙草。利用表達(dá)的抗原口服免疫小鼠，試驗(yàn)結(jié)果表明能有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)宿主細(xì)胞免受PEDV 感染的體液和黏膜免疫應(yīng)答。盡管在煙草中表達(dá)的PEDV 表位有抗原決定簇，但是外源抗原在煙草中表達(dá)水平低限制了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的發(fā)展，為此，2005 年，Kang 等在無尼古丁的煙草中表達(dá)了合成的PEDV 中和表位基因，外源抗原的表達(dá)量占全部可溶性植物蛋白的2.1%,大約是天然基因表達(dá)量的五倍，為可食轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 乳酸桿菌疫苗

乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑中的主要益生菌，廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工業(yè)。構(gòu)建乳酸桿菌質(zhì)粒載體，表達(dá)在黏膜系統(tǒng)中增殖的病原微生物的保護(hù)性抗原基因，制備綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態(tài)制劑疫苗應(yīng)用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE 和PED 的主要途徑。葛俊偉等[7，8]先后構(gòu)建了表達(dá)PEDV N 基因和中和抗原位點(diǎn)的重組干酪乳桿菌，并將表達(dá)的外源蛋白口服免疫小鼠；研究結(jié)果表明表達(dá)PEDV N 蛋白的重組干酪乳桿菌和PEDV COE 蛋白的重組干酪乳桿菌具有良好的免疫原性，可以刺激腸道產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，又可誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)特異性免疫應(yīng)答，經(jīng)口免疫小鼠能激發(fā)出特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫；在小鼠體內(nèi)顯示了很好的免疫效力,為口服疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

5 二聯(lián)苗

目前，在我國(guó)用于PED 預(yù)防和控制的疫苗主要是PED-TGE 二聯(lián)苗。由于PEDV 和TGEV 均屬于冠狀病毒，而且致病機(jī)理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯(lián)苗亦是可行的。本課題組先后研制成功PED-TGE 二聯(lián)滅活疫苗和PED-TGE 二聯(lián)弱毒疫苗[9，10]。該二聯(lián)疫苗的特點(diǎn)是：毒價(jià)高，后海穴接種（是對(duì)常規(guī)免疫途徑的突破），增強(qiáng)了免疫保護(hù)力，一次接種即可，省時(shí)、省力。經(jīng)國(guó)內(nèi)外聯(lián)機(jī)檢索查新證明，該二聯(lián)苗是國(guó)際領(lǐng)先研制成功的，并在技術(shù)上有原始創(chuàng)新。2 種疫苗主要用于妊娠母豬的，以被動(dòng)免疫保護(hù)仔豬，也用于主動(dòng)免疫保護(hù)不同日齡的豬只。其中二聯(lián)滅活苗主動(dòng)免疫保護(hù)率為96%，被動(dòng)免疫保護(hù)率為85.1%；二聯(lián)活疫苗主動(dòng)免疫保護(hù)率為97.7%，被動(dòng)免疫保護(hù)率為98%。2 種二聯(lián)疫苗的免疫期為6 個(gè)月，仔豬被動(dòng)免疫期是哺乳期至斷奶后1 周。滅活疫苗在免疫后14 d 產(chǎn)生免疫力；二聯(lián)活疫苗免疫后7 d 產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)。

6 展望

豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒是引起豬病毒性腹瀉的主要病原，而且在現(xiàn)地豬群中常?；旌细腥?，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開發(fā)研制預(yù)防3 種疾病的聯(lián)苗是切實(shí)可行的。本課題組馮力研究員等先后研制了“豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉與豬輪狀病毒三聯(lián)滅活疫苗”和“豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉與豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗”。目前，三聯(lián)活疫苗在4個(gè)省的9 個(gè)豬場(chǎng)先后進(jìn)行了不同批次疫苗的臨床試驗(yàn)（共計(jì)45 000 頭份）。臨床試驗(yàn)各豬場(chǎng)反饋效果良好，區(qū)域免疫保護(hù)率超過95%，豬場(chǎng)病毒性腹瀉發(fā)病率由原來的8%～12%下降到3%～5%，為各豬場(chǎng)減少了損失，提高了經(jīng)濟(jì)效益。這表明我們研制的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗在預(yù)防仔豬病毒性腹瀉方面效果甚佳，無副作用，是一種安全有效的疫苗，值得大規(guī)模生產(chǎn)，擴(kuò)大使用區(qū)域的范圍，加以推廣。

[1] Pensaert MB, de Bouck P (1978)A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine.Arch Virol. 58:243-247．

[2] Pensaert M B，Yeo S G (2006)Porcine epidemic diarrhea. In: Straw B E, Zimmerman JJ, D’Allaire S,Taylor D J (ed) Disease of Swine,9th edn. Blackwell Publishing, Ames,IA, pp 367-372

[3] 宣華，邢德坤，王殿瀛，等．應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒的研究[J]．中國(guó)人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1984，4（3）：202-208．

[4] 王明，馬思奇，周金法，等.豬流行性腹瀉滅活疫苗的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病,1993,5:17-19.

[5] 馬思奇，王明，周金法，馮力.豬流行性腹瀉病毒適應(yīng)Vero 細(xì)胞培養(yǎng)及以傳代細(xì)胞毒制備氫氧化鋁滅活苗免疫效力試驗(yàn).中國(guó)畜禽傳染病,1994（2）:15-19．

[6] 佟有恩，馮力，李偉杰．豬流行性腹瀉弱毒株的培育.中國(guó)畜禽傳染病，1998，20（6）：329-332．

[7] 葛俊偉，姜艷平，汪淼．表面表達(dá)豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答．生物工程學(xué)報(bào)，2009,25（6）：813-818．

[8] 葛俊偉，姜艷平，汪淼．表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點(diǎn)的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（7）:708-712．

[9] 馬思奇，王明，馮力．豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)氫氧化鋁滅活疫苗的研究．中國(guó)畜禽傳染病，1995，17（6）：23-27．

[10] 佟有恩，馮力，李偉杰．豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（6）：406-410．