豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究

王 鳳，湯德元，李春燕，王 彬，張曉杰，甘振磊，劉志杰

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性腸道傳染病。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus）的成員。主要引起豬流行性腹瀉。各種年齡、各個(gè)品種豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、架子豬、育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，成年母豬發(fā)病率為15%～90%。其發(fā)病特點(diǎn)是：日齡小，癥狀重，日齡大，癥狀輕。1 周齡哺乳仔豬常在腹瀉3～4 d 后脫水死亡，病死率達(dá)50%。斷奶豬、育肥豬癥狀較輕，腹瀉可持續(xù)4～7 d，成年豬僅發(fā)生嘔吐和厭食。PEDV 與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）同屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，2 種病毒感染后所引起發(fā)病豬的臨床癥狀、流行特點(diǎn)和病理變化都極其相似，均給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。當(dāng)前PED 發(fā)生率居高不下，發(fā)病情況也越來(lái)越復(fù)雜，出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，目前倍受廣大研究者的重視。本文主要針對(duì)PEDV 的基因組結(jié)構(gòu)、功能和PED 疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為豬流行性腹瀉基因的深入研究及對(duì)PED的預(yù)防提供參考。

1 PEDV的基因結(jié)構(gòu)及功能

PEDV 基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，與其他冠狀病毒相似，其基因組5′端有一個(gè)帽子結(jié) 構(gòu)（cap），3 ′ 端 有 一 個(gè)Poly(A)尾，基因組全長(zhǎng)為28 033 nt（PEDV CV777 毒株）?；蚪M5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）位于復(fù)制酶多聚蛋白基因上游，長(zhǎng)296 nt；5′UTR 內(nèi)含有長(zhǎng)為65～98 nt 的前導(dǎo)序列（L）和一個(gè)AUG 為起始密碼子并擁有Kozak 序列（GUUCaugC）和編碼12 個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框架（ORF）。目前，除人冠狀病毒HCV229E 外，已知的其他冠狀病毒成員都有Kozak 序列，但序列有所差異?；蚪M3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）長(zhǎng)度為334 nt，末端連有Poly(A)序列，3′UTR 內(nèi)含有由8 個(gè)堿基（GGAAGAGC）組成的保守序列，起始于poly(A)上游的73 nt處，所有冠狀病毒成員都包含這個(gè)序列，只是在基 因組中位置不同。剩余基因組序列包括6 個(gè)ORFs（見(jiàn)圖1），從5′→3′端依次為編碼復(fù)制酶多聚蛋白lab（pplab）、纖突蛋白（S）、ORF3 蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）的基因。復(fù)制酶多聚蛋白基因占全基因組2/3，長(zhǎng)20 346 nt，包括ORFIa（12 354 nt）和ORFIb（8 037 nt）2 個(gè)開(kāi)放閱讀框架，二者之間有46 nt 的重疊序列，重疊處有滑動(dòng)序列(UUUAAAC)和假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，它們能使核糖體進(jìn)行移碼閱讀(frameshifting)從而保證基因l 的正確翻譯。S 基因、E 基因、M 基因和N 基因分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，長(zhǎng)度分別為4 152 nt、231 nt、681 nt、1 326 nt。ORF3 基因長(zhǎng)675 nt，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，在每?jī)蓚€(gè)相鄰基因之間有基因間隔序列(interval sequence，IS)，它與基因組和亞基因組mRNA 的L 序列3′端有7～18 nt 相同，在病毒基因組復(fù)制和翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖1 PEDV 基因組結(jié)構(gòu)

1.1 Pol 基因

Pol 基因編碼依賴(lài)于RNA 的非結(jié)構(gòu)蛋白，即復(fù)制酶多聚蛋白1ab（pp1ab），為RNA 多聚酶。復(fù)制酶多聚蛋白分子質(zhì)量約為753 ku，有13 個(gè)預(yù)測(cè)蛋白酶切割位點(diǎn)。PEDV 基因組中S 基因上游除編碼多聚酶的基因外并無(wú)其它基因。這同缺乏PEDV 相關(guān)的血細(xì)胞凝集酶活性結(jié)果一致。因?yàn)?，如果冠狀病毒基因組存在這樣一種基因，它必定總是存在于S 和多聚酶基因之間。多聚酶基因由2 個(gè)大的重疊的開(kāi)放性閱讀框架ORF1a（12 354 nt）和ORF1b（8 037 nt） 組 成， 其 中ORF1a 和ORF1b 共有46 個(gè)核苷酸 的重疊，重疊區(qū)有一特異性7 核苷酸序列（UUUAAAC）和一假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。多聚酶基因翻譯成2 個(gè)多蛋白前體，即pp1a和pp1ab，較大的蛋白pp1ab 則是通過(guò)核糖體移碼機(jī)制合成，并需要特異性7核苷酸序列和假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。ORFla 主要編碼蛋白水解酶，包括分別切割復(fù)制酶多聚蛋白N 端和C 端的類(lèi)木瓜蛋白酶（PL-PRO）和類(lèi)脊髓灰質(zhì)炎病毒3C 蛋白酶（3CL-PRO）。PL-PRO 的切割活性對(duì)鋅具有強(qiáng)依賴(lài)性。3CL-PRO 識(shí)別底物的核心序列是（ILMF）-Q-I-（SAGC）。另外，ORF1a 編碼蛋白還含有3 個(gè)轉(zhuǎn)膜域（TM）。ORFlb 主要編碼RNA 依賴(lài)性RNA 聚合酶（RdRp），同時(shí)有3 個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域分別是鋅指蛋白域（Z）也稱(chēng)金屬結(jié)合域、螺旋酶域（He1）和保守序列域（C）。

復(fù)制酶多聚蛋白經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理后產(chǎn)生與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的一系列蛋白質(zhì)，主要功能包括負(fù)鏈RNA、前導(dǎo)RNA、sgmRNA( 亞基因組RNA)和子代病RNA 的轉(zhuǎn)錄作用以及對(duì)多聚蛋白切割產(chǎn)生具有功能產(chǎn)物的蛋白酶切割作用。因此，在病毒感染早期發(fā)揮重要作用[2]。

1.2 S（Spike）基因

PEDV S 基因的啟動(dòng)密碼子通常并不是用于啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成，而是翻譯分子量為180～220 ku 的1 383 個(gè)氨基酸的多肽，即S 蛋白，該多肽含有29個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)，是PEDV 的1 個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白,并有與其他冠狀病毒纖突蛋白相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。序列同一性比較表明，PEDVS 基因與HCV229E（人冠狀病毒）的序列分別有60%（S2 區(qū)）和37.0%（S1 區(qū)）的同源性；與FIPV（貓傳染性腹膜炎病毒）、TGEV、和CCV( 犬冠狀病毒)的S 序列分別有59.%～60.0%（S1 區(qū)）和35.5%～35.9%（S2 區(qū)）的同源性。PEDV 和HCV229E 旁側(cè)序列在迄今所測(cè)定的所有S 蛋白基因中都顯示了保守性。

S 蛋白在免疫反應(yīng)中起重要作用，在病毒感染宿主機(jī)體后介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，如識(shí)別靶細(xì)胞、促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜融合的作用[3]，故S 蛋白被認(rèn)為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原。

此外，S 蛋白有27～29 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，在低滲非離子溶劑中溶解度最大。當(dāng)pH 值為4 時(shí)，S 蛋白溶解度最大，而N 蛋白則要求pH 為9。制備的S 蛋白和N 蛋白可用作ELISA 抗原，分別命名為S-ELISA 和N-ELISA。S-ELISA 比N-ELISA 更 為 有 效。感染PEDV 豬血清中的抗S 蛋白抗體比抗N 蛋白抗體更為持久，即可在更長(zhǎng)的時(shí)間中檢測(cè)到抗S 蛋白的抗體。

1.3 ORF3 基因

ORF3 基 因 能 編 碼ORF3 蛋 白。ORF3 蛋白為223 個(gè)氨基酸的多肽，分子質(zhì)量為25.3 ku，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，其位置在116～784 個(gè)核苷酸之間。ORF3 基因編碼的產(chǎn)物存在一個(gè)含6 個(gè)His 的尾。ORF3 基因至少存在3 個(gè)可變區(qū)，有短的核苷酸缺失（2～7 nt）。對(duì)PEDV 的2 個(gè)不同分離株CV777 和Br1/87 的測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，這些核苷酸缺失2 個(gè)分離株都有。ORF3 序列中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)功能基序（Motif）：精氨酸酶信號(hào)肽和ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)。由于ORF3 基因中核苷酸缺失的存在，所以不能通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制ORF3 基因產(chǎn)物。對(duì)PEDV CV777 和Br1/87 兩個(gè)不同分離株的研究發(fā)現(xiàn)，雖然有時(shí)核苷酸缺失是在相同的位置，但缺失并不總是相同?？梢哉J(rèn)為，CV777 和Br1/87 起源于相同的病毒群，但以后各自進(jìn)化了。

Park 等（2007）對(duì)PEDV DRl3 強(qiáng)、弱毒的ORF3 序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)致弱的DRl3 在ORF3 有17 個(gè)氨基酸的缺失，為強(qiáng)、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據(jù)。說(shuō)明ORF3 基因與病毒毒力有關(guān)[4]。

1.4 sM（small membrane）基因

sM 基 因 編 碼E 蛋 白，E 蛋 白 是PEDV 最小的結(jié)構(gòu)蛋白，由76 個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)分子量為8.8 ku，其散在分布于病毒囊膜上，在病毒的自我組裝和出芽過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。PEDV 的sM 基因序列與HCV229E 和TGEV 的相比，分別有54%和29%的同源性。PEDV 2 個(gè)病毒分離株 CV777和Brl/87 的sM 基 因 嚴(yán) 格 保 守。Northern 雜交分析PEDV 亞基因組RNA 時(shí)發(fā)現(xiàn)，編碼sM 多肽的mRNA同預(yù)測(cè)的RNA5(成熟的病毒粒子中的第5 個(gè)RNA 組分)電泳遷移率相同。目前，研究者將PEDV 的sM 基因和M 基因?qū)爰撞《据d體(pS～FV)，在BHK-21 細(xì)胞中得到了成功的表達(dá)，為進(jìn)一步探討E 蛋白和M 蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1.5 M（Membrane）基因

M 基 因 編 碼M 蛋 白，M 蛋 白 是一種穿膜蛋白，由226 個(gè)氨基酸組成，分子量介于27～32 ku 之間。對(duì)M基因的序列比較分析表明，PEDV 與HCV229E 和TGEV 的同源性分別為57%和53%。CV777 和Br1/87 核苷酸序列比較分析表明，在M 基因上僅有2 個(gè)核苷酸的差異。M 基因非常保守，PCR 檢測(cè)時(shí)PEDV 的引物一般都是針對(duì)M 基因而設(shè)計(jì)的。

M 蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過(guò)程中具有重要作用，同時(shí)也是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)蛋白。另外，M 蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，所以M 蛋白可以作為PEDV 基因工程疫苗的候選基因[5]。因此獲得M 基因在體外有效的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，無(wú)論是對(duì)PEDV 感染增殖的基礎(chǔ)性研究，還是利用M 蛋白進(jìn)行病原鑒定或疾病免疫預(yù)防，均具有重要的理論和實(shí)踐意義。現(xiàn)已用兔抗肽血清鑒定PEDV M 蛋白，并用桿狀病毒進(jìn)行了表達(dá)。

活性的M 蛋白為N-糖基化，分子量約為27 ku，而重組體桿狀病毒合成的M 蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量）Mr 為23ku，且與未糖基化的M 蛋白有著相同的電泳遷移率。

1.6 N（nucleocapsid）基因

PEDV N 基 因 編 碼N 蛋 白。N 蛋白是PEDV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，主要作用是形成核衣殼，相對(duì)分子量為大小為55～58 ku，由441 個(gè)氨基酸組成。對(duì)PEDV CV777 和Brl/87 2 個(gè)分離株N 基因序列分析發(fā)現(xiàn)僅有2 個(gè)堿基的差異，用套式PCR 擴(kuò)增4 個(gè)分離株P(guān)EDV N 基因540 nt 的片段后發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列基本相同。N 基因1 323個(gè)核苷酸的序列表明，PEDV 與其他冠狀病毒N 基因序列有相當(dāng)部分相同。但PEDV N 基因明顯比HCV229E 和TGEV 大，其中有一段大約135 nt 的潛在插入存在，其可能位于N 基因中央。PEDV 與TGEV、HCV229E 的N 蛋 白的明顯不同之處就是在PEDV N 蛋白中央部分有一段接近40 個(gè)氨基酸的特別殘基，其中富含天門(mén)冬酰胺，絲氨酸和精氨酸。N 基因在氨基酸和核苷酸水平上與HCV229E 有很大的同源性，其序列與MHV、IBV、HCV 的同源性為12%～19%，與FIPV、CCV、PRCV、TGEV、HCV229E 的同源性較高，為32%～37%。N 蛋白氨基酸序列比較，PEDV 和HCV229E 有63 個(gè) 相 同 的 殘基，而和TGEV 有49 個(gè)相同的殘基。PEDV、TGEV、HCV229E 的N 端 序列的一致性比C 端高。

N 基因處于PEDV 基因組3′端，N 基因的3′端和poly（A）尾之間有一個(gè)11 個(gè)核苷酸的保守序列，這一序列是病毒復(fù)制過(guò)程中RNA 負(fù)鏈合成的識(shí)別位點(diǎn)。N 基因的5′端也存在一個(gè)類(lèi)似于內(nèi)部保守基因?yàn)? nt 的序列。N基因還有一個(gè)336 個(gè)核苷酸的ORF，編碼富含Leu 的蛋白。適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的PEDV N 基因含有3 個(gè)內(nèi)部開(kāi)放閱讀 框（internal open reading frames，I ORF），分別命名為I-1（113 個(gè)密碼子），I-2（63 個(gè)密碼子）和I-3（72個(gè)密碼子），3 個(gè)I ORF 均絕對(duì)保守。而牛的冠狀病毒(BCV)I ORF (208 個(gè)密碼子)表達(dá)一個(gè)與膜有關(guān)的23 Ku的蛋白，但其生物學(xué)作用仍有待測(cè)定。MHV（鼠肝炎病毒）的I ORF (207 個(gè)密碼子)編碼一結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白與病毒復(fù)制無(wú)關(guān)。PEDV 所有3 個(gè)I ORF 的共同編碼作用與BCV 或MHV 大約相當(dāng)。野生型PEDV CV777 分離株3′端整個(gè)N 基因和非編譯區(qū)的1 800 個(gè)核苷酸序列分析表明，野生型PEDV 同適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的PEDV 相似，N 基因下游未發(fā)現(xiàn)其他基因。病毒的細(xì)胞培養(yǎng)不會(huì)導(dǎo)致該基因組區(qū)任何核苷酸的變化，然而，適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的PEDV 對(duì)新生仔豬的致病力是明顯減弱了，這證明了該段基因及其基因產(chǎn)物對(duì)PED 病毒致弱無(wú)關(guān)。

不同冠狀病毒N 蛋白比較顯示：在PEDV N 蛋白中央有相當(dāng)長(zhǎng)的親水區(qū)域。另外N 蛋白除和基因組RNA 纏繞形成核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合體外，還參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[6]。N 蛋白等電點(diǎn)高，缺少糖基化和RNA 結(jié)合位點(diǎn)，PEDV 完整的N 蛋白等電點(diǎn)為10.5，但C 端50 個(gè)殘基的等電點(diǎn)很低，僅為3.4，這是由于其C端殘基通常是帶負(fù)電荷或呈中性。病毒感染細(xì)胞中N 蛋白較豐富，N 蛋白能與病毒多聚酶作用，或許還有可能同細(xì)胞因子作用，從而改變宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。N 蛋白有6～7 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，在pH 9.0 低滲非離子溶劑中溶解度最大。N 蛋白有3 個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，位于中間的是一個(gè)能與病毒RNA 前導(dǎo)列結(jié)合的RNA 結(jié)合域。

此外，在對(duì)冠狀病毒一些成員N 蛋白亞細(xì)胞定位的研究中表明N 蛋白在細(xì)胞核(或核仁)中定位的特征，進(jìn)而也闡明了N 蛋白的一些功能，N 蛋白作為一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白起作用，能夠干擾宿主細(xì)胞周期，參與細(xì)胞通信，N 蛋白還可以抑制干擾素的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。而對(duì)PEDV N 蛋白亞細(xì)胞定位特征的研究還沒(méi)有報(bào)道。N 蛋白在PEDV 的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，在感染的細(xì)胞中能得到大量表達(dá)。豬在感染PEDV 的早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N 蛋白的高水平抗體。又鑒于其冠狀病毒N 蛋白保守性強(qiáng)，所以利用N 蛋白來(lái)建立PEDV 分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[7]。

2 PED疫苗的研究

對(duì)PED 的預(yù)防和控制應(yīng)以接種疫苗為主，國(guó)內(nèi)外的研究者在PED 疫苗的研究方面已經(jīng)做了大量的工作，但到目前為止還沒(méi)有研制出特別有效的疫苗可以控制PED 疾病的發(fā)生。下面僅就豬流行性腹瀉各類(lèi)疫苗的研究應(yīng)用現(xiàn)狀及前景進(jìn)行概述。

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗包括組織滅活疫苗和細(xì)胞滅活疫苗。由于組織滅活苗效果很好，目前應(yīng)用最為廣泛。哈爾濱獸醫(yī)研究所、上海農(nóng)科院牧醫(yī)所和江蘇農(nóng)科院牧醫(yī)所等單位試生產(chǎn)。王明等[8]用PED滬株研制氫氧化鋁滅活苗接種后海穴，以0.1mL/頭主動(dòng)免疫3 日齡仔豬，保護(hù)率為77.28%；以0.5mL/頭主動(dòng)免疫接種3～22 日齡豬，保護(hù)率為85%；以5mL/ 頭被動(dòng)接種妊娠母豬，其所產(chǎn)3 日齡仔豬的保護(hù)率為97.06%。接種疫苗后14d 開(kāi)始產(chǎn)生免疫力，免疫期可達(dá)6 個(gè)月。

細(xì)胞滅活苗制備方便，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。馬思奇等[9](1994)研制的氫氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗的主動(dòng)免疫試驗(yàn)和被動(dòng)免疫試驗(yàn)的保護(hù)率分別為88.89%及90.7%，并研制了豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)氫氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗，滅活前毒價(jià)均為107.0～107.5TCID50/0.3 mL， 主動(dòng)免疫保護(hù)率：TGE 為100%、PED為92%，被動(dòng)免疫保護(hù)率：TGE 為87.9%、PED 為 82.4%，免疫期均為6個(gè)月。疫苗保存期1 年，田間試驗(yàn)保護(hù)率92%～96.35%。

2.2 細(xì)胞弱毒苗

由于滅活苗產(chǎn)生完全免疫力需要2周時(shí)間，且劑量偏大，不利于緊急預(yù)防與降低疫苗費(fèi)用，所以又研制了細(xì)胞弱毒苗。國(guó)外Park 等[10]將PEDV經(jīng) Vero 細(xì)胞致弱后的毒株DR13，通過(guò)口服和肌肉注射兩種途徑免疫晚期妊娠母豬，觀察所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率。結(jié)果口服免疫組的發(fā)病率（13%）遠(yuǎn)低于肌肉注射免疫組（60%），且口服免疫組仔豬抗PEDV 的SIgA 含量明顯高于肌肉注射免疫組。研究表明，可應(yīng)用PEDV 細(xì)胞弱毒苗經(jīng)口免疫晚期妊娠母豬，從而有效預(yù)防PEDV 感染。Kweon 等[11]用分離到的野毒株（命名為KPEDV-9），使之適應(yīng)Vero 細(xì)胞并連續(xù)傳代至93 代，進(jìn)行主動(dòng)免疫試驗(yàn)、被動(dòng)免疫試驗(yàn)以及安全性試驗(yàn)，結(jié)果都證實(shí)可作為弱毒苗使用。適應(yīng)Vero 細(xì)胞并連續(xù)傳代至93 代的KPEDV-9，接種妊娠母豬，ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，母豬免疫應(yīng)答水平大幅度提高，且新生仔豬可抵抗PEDV 野毒感染。國(guó)內(nèi)佟有恩等[12]用CV777 株強(qiáng)毒株適應(yīng)Vero細(xì)胞系，并在83 代后適應(yīng)了仔豬腎原代細(xì)胞。以104～124 代細(xì)胞適應(yīng)毒制備5 批疫苗，主動(dòng)免疫試驗(yàn)的總保護(hù)率為95.92%；以106～139 代細(xì)胞適應(yīng)毒制備的8 批疫苗，主動(dòng)免疫試驗(yàn)的總保護(hù)率為96.2%。在與TGEV 弱毒組合制備的二聯(lián)弱毒苗的初步田間試驗(yàn)中取得良好效果。

2.3 乳酸桿菌疫苗

乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑中的主要益生菌，廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工業(yè)。構(gòu)建乳酸桿菌質(zhì)粒載體，表達(dá)在黏膜系統(tǒng)中增殖的病原微生物的保護(hù)性抗原基因，制備綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態(tài)制劑疫苗應(yīng)用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE 和PED 的主要途徑。因此，研制刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)的TGE 和PED 基因工程乳酸桿菌疫苗有重要意義。目前，有的實(shí)驗(yàn)室正在開(kāi)展乳酸桿菌表達(dá)TGEV、PEDV 主要保護(hù)性抗原基因的研究。此研究擬從健康豬體內(nèi)分離鑒定出乳酸桿菌，并進(jìn)一步篩選出thyA 基因缺陷型乳酸桿菌，構(gòu)建含有TGEV 或PEDV主要保護(hù)性抗原基因的以thyA 基因?yàn)檫x擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化乳酸桿菌，制備基因工程乳酸桿菌疫苗。目前已篩選出2 株thyA 基因缺陷型乳酸桿菌，并已初步鑒定。TGEV、PEDV 的S 基因的克隆擴(kuò)增工作亦已結(jié)束[13]。

2.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

Yang 等[14]（2003）將PEDV 的S基因轉(zhuǎn)入煙草中，提取轉(zhuǎn)基因植物蛋白給小鼠注射，進(jìn)行血清蝕斑減數(shù)中和測(cè)定，證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫。Yang 等[15]（2005）相繼應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)入法將PEDV 的S 基因的主要抗原位點(diǎn)（命名為K-COE）和合成的PEDV 中和抗原表位在煙草中表達(dá)，前者重組體蛋白占轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶性植物蛋白含量的0.1%，后者含量則為2.1%。這些研究為研制PEDV 口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了新的思路。目前，在以煙草花葉病毒為載體的無(wú)煙堿煙草植物中PEDV 的S 蛋白中和表位得到了成功表達(dá)，用表達(dá)蛋白免疫接種后，對(duì)仔豬具有良好的保護(hù)作用，為PEDV 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。一些研究者將PEDV的E 基因和M 基因?qū)爰撞《据d體中，在BHK-21 細(xì)胞中得到了成功表達(dá)，這為進(jìn)一步探討E 蛋白和M 蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ)。植物的多種優(yōu)越性均可被用于研究轉(zhuǎn)基因疫苗，并且已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。但仍有一些障礙必須克服，如蛋白在植物中的表達(dá)水平低、表達(dá)產(chǎn)物在植物中的穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)基因口服疫苗在產(chǎn)生免疫反應(yīng)之前在胃腸道內(nèi)有時(shí)被消化等，科學(xué)家就這些問(wèn)題進(jìn)行了研究并正在加以解決。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗又稱(chēng)為基因疫苗、DNA疫苗，是20 世紀(jì)90 年代初從基因治療研究領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的一種全新疫苗，與傳統(tǒng)的弱毒或滅活疫苗相比，DNA 疫苗具有不散毒、不返強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。DNA疫苗還具有可以制成標(biāo)記性疫苗，便于臨床診斷監(jiān)測(cè)；疫苗性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸；應(yīng)用范圍廣，不僅可用于傳染病和寄生蟲(chóng)病的免疫預(yù)防，而且還能夠用于腫瘤、自身免疫、過(guò)敏反應(yīng)等疾病的治療等優(yōu)點(diǎn)。另外，與亞單位疫苗相比，具有能長(zhǎng)期激發(fā)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、制備工藝簡(jiǎn)單和費(fèi)用低廉(不用純化蛋白)的優(yōu)點(diǎn)。雖然核酸疫苗兼具亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗的有效性，但核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產(chǎn)生抗菌素DNA 抗體等危險(xiǎn)性，其安全性還有待于進(jìn)一步觀察。豬流行性腹瀉核酸疫苗的研究還處于起步階段，是今后研究的熱點(diǎn)之一。

2.6 多價(jià)聯(lián)合疫苗

TGEV 和PEDV 均屬冠狀病毒，致病機(jī)理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯(lián)苗亦是可行的。尤其在我國(guó)豬病毒性腹瀉廣泛流行，研制多聯(lián)苗更是十分必要的。

2.6.1 TGEV 與PEDV 二聯(lián)疫苗

該系列產(chǎn)品包括豬傳染性胃腸炎（TGE）和豬流行性腹瀉（PED）二聯(lián)滅活苗、二聯(lián)活疫苗和弱毒二聯(lián)疫苗，二聯(lián)滅活苗和二聯(lián)活疫苗是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的馬思奇、佟有恩共同主持完成的。該二聯(lián)疫苗的特點(diǎn)是：毒價(jià)高，后海穴接種(是對(duì)常規(guī)免疫途徑的突破)，增強(qiáng)了免疫保護(hù)力，一次接種即可，省時(shí)、省力。經(jīng)國(guó)內(nèi)外聯(lián)機(jī)檢索查新證明，該二聯(lián)苗是國(guó)際領(lǐng)先研制成功的，并在技術(shù)上有原始創(chuàng)新。兩種疫苗可用于主動(dòng)免疫保護(hù)不同年齡的豬只，但主要用于妊娠母豬的被動(dòng)免疫以保護(hù)仔豬。其中二聯(lián)滅活苗主動(dòng)免疫保護(hù)率為96%，被動(dòng)免疫保護(hù)率為85.1%；二聯(lián)活疫苗主動(dòng)免疫保護(hù)率為97.7%，被動(dòng)免疫保護(hù)率為98%。2種二聯(lián)疫苗的免疫期均為6 個(gè)月，仔豬被動(dòng)免疫期是哺乳期至斷奶后1 周。二聯(lián)滅活疫苗在免疫后14 d 產(chǎn)生免疫力；二聯(lián)活疫苗免疫后7 d 產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)。PED 和TGE 弱毒二聯(lián)疫苗是用豬流行性腹瀉弱毒疫苗株P(guān)EDV-G1P83 和豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗株TGEV-AG1制成。用該弱毒二聯(lián)疫苗進(jìn)行了保存期試驗(yàn)、安全效力、免疫期試驗(yàn)和區(qū)域試驗(yàn)。結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗在－20 ℃保存4 個(gè)月，經(jīng)4 個(gè)月保存的疫苗免疫效力未見(jiàn)下降。4 ℃保存48 h 對(duì)疫苗病毒的毒價(jià)沒(méi)有明顯影響。用該弱毒二聯(lián)疫苗按程序免疫妊娠母豬，對(duì)妊娠母豬安全，其仔豬獲得了良好的被動(dòng)免疫。其對(duì)PEDV 強(qiáng)毒、TGEV 強(qiáng)毒和2 種 強(qiáng)毒混合攻擊的免疫效力分別達(dá)90.48%、93.75%和87.5%。用二聯(lián)弱毒疫苗免疫8～10 日齡的哺乳仔豬證明安全，28 日齡時(shí)(25 日齡斷奶)分別用PEDV強(qiáng)毒、TGEV 強(qiáng)毒和2 種混合強(qiáng)毒攻擊，免疫效力分別為100%、99.9%和73.3%。結(jié)果表明，該弱毒二聯(lián)疫苗能夠安全地對(duì)妊娠母豬和哺乳仔豬進(jìn)行免疫，免疫后能有效地保護(hù)初生仔豬、斷奶豬和肥育豬抵抗TGEV 和PEDV 強(qiáng)毒的攻擊。該弱毒二聯(lián)疫苗在區(qū)域試驗(yàn)中能顯著降低豬病毒性腹瀉的發(fā)病率和死亡率。

2.6.2 PEDV、TGEV、RV 三 聯(lián)滅活苗

上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所錢(qián)永清等[17]采用豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(RV)細(xì)胞培養(yǎng)物制備了三聯(lián)滅活疫苗。實(shí)驗(yàn)室免疫結(jié)果表明，妊娠母豬和育肥豬免疫后15 d 達(dá)到較高的免疫水平，免疫有效期超過(guò)6 個(gè)月，妊娠母豬所產(chǎn)仔豬可獲得高水平的被動(dòng)免疫保護(hù)。試驗(yàn)場(chǎng)應(yīng)用結(jié)果表明，母豬保護(hù)率達(dá)98%，仔豬被動(dòng)免疫保護(hù)率達(dá)93%。

綜上所述，PEDV 的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA。其中Pol 基因在病毒感染早期發(fā)揮重要作用，S 基因被認(rèn)為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原ORF3 基因與病毒毒力有關(guān)，sM 基因在病毒的自我組裝和出芽過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，M 基因編碼的M 蛋白可以作為PEDV 基因工程疫苗的候選抗原，又鑒于冠狀病毒N 蛋白保守性強(qiáng)，所以利用N 基因編碼的N蛋白來(lái)建立PEDV 分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。但豬流行性腹瀉病毒全基因組結(jié)構(gòu)還需要深入研究。疫苗研制的最佳構(gòu)想應(yīng)該包括安全、有效果、多價(jià)、成本低及保存和使用方便等，但要達(dá)到上述目標(biāo)還需要一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。PED 疫苗的研究已經(jīng)取得了一些可喜的進(jìn)展，隨著人們對(duì)病毒致病原認(rèn)識(shí)的不斷深入，研制的PED 疫苗也在不斷完善，相信不久的將來(lái)科學(xué)家們會(huì)研制出特別有效的疫苗來(lái)控制PED 疾病的發(fā)生。

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