圓山藥的離體培養(yǎng)

金 密，彭曉英，周雙德，彭盡暉，李 英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

圓山藥的離體培養(yǎng)

金 密，彭曉英*，周雙德，彭盡暉，李 英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為建立圓山藥的離體培養(yǎng)體系，將野生苗盆栽后，切取其嫩葉、莖段、地下塊莖和不定根作為外植體，探討不同消毒方式的影響及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化、不定芽誘導(dǎo)及腋芽增殖的影響。結(jié)果表明： ① 腋芽增殖途徑的培養(yǎng)基配方為 MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L(增殖系數(shù)為3.1)；② 適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+2,4 — D 4mg/L +6 — BA 0.5mg/ L，其中以帶腋芽的莖段為外植體誘導(dǎo)率較高，可達(dá)85.7%。BA濃度為4.0～6.0mg/L時(shí)，不定芽的形成率最高，達(dá)97.5%；③ 增加BA和瓊脂的濃度利于防止圓山藥的褐化。

薯蕷；圓山藥；離體培養(yǎng)；愈傷組織；不定芽

圓山藥(Dioscorearotundata)俗稱白薯蕷，為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)植物，它地上部分為大型藤本，地下具有團(tuán)塊狀的塊莖，與黃薯蕷(Dioscoreacayenensis)為相同種，通稱幾內(nèi)亞薯蕷，原產(chǎn)非洲，為當(dāng)?shù)鼐用竦闹饕澄镏?。塊莖中不僅具有較高含量的碳水化合物，還有蛋白質(zhì)和其他的成分，也廣泛用于保健品和壯陽(yáng)藥物的制造[1-2]。

因圓山藥的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值較高，國(guó)外對(duì)其進(jìn)行試管苗和微塊莖的離體誘導(dǎo)報(bào)道較多[1-2]，但國(guó)內(nèi)的報(bào)道較少。本研究擬以產(chǎn)于日本的當(dāng)年生圓山藥塊莖為材料，篩選適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，建立離體培養(yǎng)體系，便于圓山藥在我國(guó)的馴化引種和有效成分提取的研究[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

以產(chǎn)于日本的當(dāng)年生圓山藥塊莖(重約100g)為材料(如圖1)，置于人工氣候箱中發(fā)芽后種于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)基地。待長(zhǎng)出大量藤蔓后，分別切割其地上各部分和地下塊莖作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與接種 將各外植體以流水沖凈，用70%酒精浸泡(30s)后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中消毒(9min)，無(wú)菌水沖洗3次。把葉片切塊(1cm×1cm)、莖段切段(0.8～1cm)，塊莖切塊(1cm×1cm×2mm)，分別接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，探討不同消毒方式對(duì)培養(yǎng)的影響。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)條件 基本培養(yǎng)基為MS，附加不同種類和濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4 — D、6 — BA和NAA等)，蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH值為5.8～6.0。121 ℃高壓滅菌20min。以上每組試驗(yàn)中每100mL三角瓶接種4枚外植體，10瓶為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。探討不同消毒方式對(duì)培養(yǎng)的影響。

培養(yǎng)條件： 培養(yǎng)溫度為24±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間12～14h/d。

1.2.3 圓山藥組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的研究 BA的濃度對(duì)褐化的影響: 取墨西哥薯蕷的莖段，常規(guī)滅菌后分別接種在MS+2,4 — D 2.0mg/L+BA(0.5～5mg/L),pH為5.8～6.0,附加蔗糖3%、瓊脂濃度0.7%的培養(yǎng)基上，觀察BA的濃度對(duì)褐化的影響。(其他培養(yǎng)條件同上)

培養(yǎng)基硬度對(duì)褐化研究: 不同的外植體經(jīng)常規(guī)滅菌后，接種在MS+2，4 — D 2.0mg/L+BA 0.5mg/L，附加不同濃度瓊脂，pH為5.8～6.0，附加蔗糖3%的培養(yǎng)基上(其他培養(yǎng)條件同上)，觀察培養(yǎng)基的硬度對(duì)褐化的影響。

以上各項(xiàng)試驗(yàn)均為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓山藥的腋芽增殖培養(yǎng)

將圓山藥帶腋芽的莖段接種在不同的培養(yǎng)基中，觀察不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)墨西哥薯蕷莖段增殖的影響。35d后統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽增殖的影響Tab.1 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonbudmultiplication培養(yǎng)基編號(hào)No.MediumBA(mg/L)KT(mg/L)NAA(mg/L)接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofexplants增殖倍數(shù)Timesofmultiplication10.20.00.2401.020.50.00.2401.031.00.00.2401.842.00.00.2402.253.00.00.2403.164.00.00.2402.770.01.00.2401.180.02.00.2401.5

從表1可知：帶腋芽的莖段經(jīng)35d培養(yǎng)后，在以MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的培養(yǎng)基上，芽的增殖倍數(shù)最低，僅為0.3，大部分圓山藥的莖段的基部褐化嚴(yán)重，腋芽枯黃，最后死亡；而當(dāng)BA 濃度為3.0mg/L、NAA為0.2mg/L 的培養(yǎng)基上，墨西哥薯蕷莖段基部也有部分褐化，但芽正常生長(zhǎng)(如圖3)，此時(shí)芽的增殖倍數(shù)達(dá)最高，平均為3.1。表明高濃度的BA和低濃度的NAA配比有利于墨西哥薯蕷的增殖。當(dāng)添加的細(xì)胞分裂素為KT時(shí)，發(fā)現(xiàn)腋芽開始生長(zhǎng)，但幾乎無(wú)新芽長(zhǎng)出，相對(duì)于同濃度的BA來(lái)說(shuō)，其芽的增殖率較低，但腋芽健壯，莖段加粗。由此可見，MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L有利于腋芽增殖。且隨著BA濃度增加到3.0mg/L，芽的增殖倍數(shù)最高。而MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L則有利于腋芽生長(zhǎng)。

2.2 圓山藥愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 不同外植體對(duì)圓山藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以圓山藥的葉片、莖段、以及塊莖為外植體,分別接種在附加2,4 — D 4.0mg/L、BA 1.0mg/L的MS基本培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。35d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率,觀察不同外植體對(duì)圓山藥愈傷組織形成的影響。結(jié)果見表2。

2.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)墨西哥薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將墨西哥薯蕷的莖段接種在以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)室中培養(yǎng),35d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率,結(jié)果見表3。

表2 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effectsofdifferentexplantsoncallusinduction外植體Originofexplants接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofexplants形成愈傷組織塊數(shù)(塊)Numberoftissuesformedcallus愈傷組織誘導(dǎo)率(%)Inductionrateofcallus葉片402255.0莖段402665.0帶腋芽的莖段353085.7塊莖4200.0

從表3中可以看出: 圓山藥愈傷組織的誘導(dǎo)受不同濃度配比生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響。在MS附加2,4 — D 4.0mg/L和BA 1.0mg/L時(shí)圓山藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高,為80 %,此時(shí)愈傷組織質(zhì)地緊密,為白色顆粒狀(如圖2),但此類愈傷組織在繼代培養(yǎng)中易于褐化。在附加NAA 4.0mg/L與 BA 1.0mg/L的培養(yǎng)基上,愈傷組織也是白色,質(zhì)地致密,但是愈傷組織誘導(dǎo)率較低?？梢?在含有低濃度的生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上, 圓山藥的莖段很難被誘導(dǎo)形成愈傷組織.在附加2,4 — D與BA組合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的效果好,并且生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值偏大,有利于提高誘導(dǎo)率。

表3 不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsoncallusinduction生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulators接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofexplants形成愈傷組織的塊數(shù)(塊)Numberoftissuesformedcallus愈傷組織誘導(dǎo)率(%)InductionrateofcallusNAA2,4—DBA1.00.00.53300.02.00.00.533618.14.00.01.0341647.00.01.00.13500.00.02.00.5361233.30.04.00.5322268.80.04.01.0302480.01.00.03.0311032.22.00.00.537821.6

同濃度的 2,4 — D和NAA比較,2,4 — D對(duì)墨西哥薯蕷愈傷組織的誘導(dǎo)率雖然較低為32.2%,但所生成的愈傷組織為鮮綠色,質(zhì)地緊密,且在繼代培養(yǎng)中增殖較快,不易褐化死亡。

綜上所述，適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為MS+2,4 — D 4.0mg/L+BA 0.5mg/L或MS+BA 4.0mg/L+2,4 — D 0.5～1.0mg/L。

2.3 叢生芽誘導(dǎo)

將墨西哥薯蕷的頂芽接種在以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)接種10d后，愈傷組織的表面有許多小芽點(diǎn)，此后，小芽點(diǎn)逐漸長(zhǎng)大形成綠色的不定芽(如圖3)。35d統(tǒng)計(jì)芽增殖數(shù)，結(jié)果見表4。

從表4可以看出： 低濃度的BA對(duì)墨西哥愈傷組織形成芽的影響較小，當(dāng)BA濃度為1.0mg/L時(shí)，不定芽的形成率僅為12.5%，每塊愈傷組織產(chǎn)生的芽數(shù)最多為3個(gè)；隨著BA濃度的升高，墨西哥薯蕷組織的分化率增加，所形成的芽數(shù)增多，當(dāng)BA濃度為4.0～6.0mg/L時(shí)，不定芽的形成率最高，達(dá)97.5%，且每塊愈傷組織生成的不定芽數(shù)也最多，平均為9個(gè)，但在BA濃度為6.0mg/L，可觀察到部分不定芽發(fā)生了玻璃化現(xiàn)象。在KT與NAA配比的培養(yǎng)基上，墨西哥薯蕷的愈傷組織也可以分化，產(chǎn)生不定芽，但其不定芽的形成率僅為同濃度BA的70%左右，生成的芽數(shù)也較少。結(jié)果表明，墨西哥薯蕷叢生芽的誘導(dǎo)所適用BA的濃度為4.0mg/L。

表4 不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonbudregeneration生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulators接種愈傷組織塊數(shù)(塊)Numberofinoculatedcallus產(chǎn)生不定芽愈傷組織數(shù)(個(gè))Numberofcallusformedbuds分化率(%)Differentiationrate增殖倍數(shù)TimesofmultiplicationBAKTNAA1.00.00.240512.532.00.00.2401537.564.00.00.2403997.566.00.00.2403997.590.02.00.2401332.530.04.00.2403177.54

2.4 試管苗的生根

不定芽長(zhǎng)至3～4cm時(shí)，將其切下，接種在供試培養(yǎng)基上，觀察不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)圓山藥試管苗生根的影響。結(jié)果見表5。

表5結(jié)果顯示，在25d時(shí)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)圓山藥的生根率影響效果不太明顯，但隨時(shí)間延長(zhǎng)至35d時(shí)，莖葉繁茂的植株能依靠自身產(chǎn)生不定根，最高可達(dá)到88%。 具有自身所產(chǎn)不定根的植株移栽成活率可達(dá)到100%。

表5 不同種類和濃度配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)試管苗生根的影響Tab.5 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonrootinduction基本培養(yǎng)基Mediumtype生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulator接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofexplants25d生根率(%)Rootingrateat25d35d生根率(%)Rootingrateat35dNAABAKT1/2MS1.00.00.0400.0301/2MS0.00.20.04033.3781/2MS0.00.00.24036.6851/2MS0.00.00.24032.0821/2MS1.00.20.04041.288MS1.00.00.24025.576

圓山藥不同外植體在組織培養(yǎng)的過(guò)程中均會(huì)發(fā)生不同程度的褐化現(xiàn)象，多出現(xiàn)在培養(yǎng)材料的切口處(如圖6)。

2.5 BA濃度對(duì)褐化的影響

取室內(nèi)栽培的墨西哥薯蕷的莖段，經(jīng)常規(guī)滅菌后接種在以MS為基本培養(yǎng)基和附加不同濃度BA和同一濃度的2，4 — D的培養(yǎng)基上，結(jié)果見表6。

表6 不同濃度6—BA對(duì)褐化現(xiàn)象的影響Tab.6 Effectsofdifferentconcentrationof6—BAonpla-ntletbrowning6—BA濃度(mg/L)Concentrationof6-BA接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofexplants褐化數(shù)(個(gè))Numberofbr-owningtissues褐化率(%)Browningrate0.5402665.02.0402152.54.0401640.06.0401435.0

從表6可以看出，不同濃度的BA對(duì)圓山藥組織褐化現(xiàn)象有明顯的影響。當(dāng)BA為0.5mg/L時(shí)，褐化率最高達(dá)65.0%，而當(dāng)BA濃度為6.0mg/L時(shí)，褐化率降低了1倍多。由此可見：隨著BA濃度的升高，褐化率也隨之下降。在培養(yǎng)基中適當(dāng)增加BA的濃度有利于防止圓山藥的褐化現(xiàn)象。

2.6 培養(yǎng)基硬度對(duì)褐化的影響

將圓山藥的莖段常規(guī)消毒后接種在MS+2,4 — D 3.0mg/L+BA 0.5mg/L附加不同瓊脂濃度的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d，統(tǒng)計(jì)褐化率，結(jié)果見表7。

由表7可以看出，當(dāng)瓊脂濃度為7.5g/L時(shí)，褐化率最低，為37.5%，但培養(yǎng)基過(guò)硬，不利于外植體對(duì)培養(yǎng)基中養(yǎng)料的吸收，進(jìn)而影響愈傷組織的形成。由此可見，瓊脂濃度升高，培養(yǎng)基硬度增大，褐化則降低，反之亦然。

表7 培養(yǎng)基硬度對(duì)褐化研究Tab.7 Effectsofdifferentconcentrationofagaronbrowning瓊脂濃度(g/L)Concentrationofagar接種外植體數(shù)(個(gè))Numberofinoculatedcallus褐化數(shù)(個(gè))Numberofbrowningcallus褐化率(%)Browningrate5.5402767.56.5402050.07.5401537.5

3 討論

本試驗(yàn)中，嚴(yán)重影響培養(yǎng)的一個(gè)重要因素就是當(dāng)外植體的生長(zhǎng)速度小于其褐化的進(jìn)程時(shí)，整個(gè)外植體會(huì)大面積褐化；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體逐漸完全褐化、死亡。而褐化的物質(zhì)會(huì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中累積起來(lái)，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色的改變和培養(yǎng)效果的降低。這與顏昌敬[6]的觀點(diǎn)一致。盡管嚴(yán)重的褐化在該試驗(yàn)中無(wú)法消除，但采取適當(dāng)方法，可以從一定程度上減輕其影響。

徐振彪等[7]指出影響變褐的因素很多，接種時(shí)外植體的處理、培養(yǎng)溫度、外植體種類、培養(yǎng)基種類、繼代次數(shù)、外植體的放置方式、活性炭對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程中的變褐現(xiàn)象有影響。

有研究表明，隨著BA濃度的升高，外植體的褐化率也隨之升高[8-9]，而在本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著BA濃度的升高，褐化率則隨之下降。2，4 — D所產(chǎn)生的愈傷組織容易褐化，在取不同濃度的BA組合中，高濃度BA所產(chǎn)生的愈傷組織顏色鮮綠，不易褐化。推測(cè)產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是不同植物對(duì)BA的反應(yīng)不同，墨西哥薯蕷在較高濃度的BA時(shí)可以產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)而使外植體的生長(zhǎng)速度大于其褐化的進(jìn)程。

因此，今后要從如何降低褐化程度著手，進(jìn)而達(dá)到加快繁殖的目的。

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(責(zé)任編輯：譚著明)

InvitrocultureofDioscorearotundata

JIN Mi, PENG Xiaoying*, ZHOU Shuangde, PENG Jinhui, LI Ying

(Bioscience and Biotechnology College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Aninvitroprotocol was developed for multiplication ofDioscorearotundataby using leaves, stem, tuber and adventitious root derived from plants grown in pot as explants. Effects of different plant growth regulators on callus induction, callus differentiation, adventitious bud induction and axillary bud multiplication were studied. The results showed that the optimum medium for proliferation of axillary bud located below the shoot tip was MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L (3.1 for coefficient of multiplication). The optimum medium for callus induction was MS+2,4-D 4mg/L+6-BA 0.5mg/L, and the rate of callus inducement was as high as 85.7% when stems with axillary buds were used as explants. When the concentration of BA was 4.0～6.0mg/L, the rate of adventitious bud formation could up to 97.5%. Increasing the concentration of BA and agar could decrease browning during the culture.

Dioscorea;Dioscorearotundata; vitro culture; callus; adventitious bud

2010 — 09 — 20

2010 — 11 — 19

金 密(1975 — )，女，湖南省長(zhǎng)沙市人，講師，碩士，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)。

* 為通訊作者

S 632.1

A

1003 — 5710(2010)06 — 0001 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2010. 06. 001