通化縣產(chǎn)細(xì)辛的HPLC指紋圖譜研究

張海豐,滕 坤,吳 艷

(通化師范學(xué)院,吉林通化134001)

細(xì)辛是常用中藥,具有解表散寒、溫肺化飲、祛風(fēng)止痛等功效,主要藥效成分是揮發(fā)油,并經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、麻醉等藥理活性[1]。2000版《中國(guó)藥典》將北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schm idt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai和華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.列為正品,并對(duì)細(xì)辛藥材的一般質(zhì)量指標(biāo)如揮發(fā)油含量、雜質(zhì)、灰分等作了規(guī)定[2]。但這種質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)尚不能全面反映細(xì)辛藥材的內(nèi)在質(zhì)量。近年來, 中藥指紋圖譜技術(shù)已被用于中藥的質(zhì)量控制及鑒定, 其優(yōu)點(diǎn)在于可以比較全面地反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例[3]。本研究采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地細(xì)辛藥材進(jìn)行指紋圖譜研究,以期為控制其藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 系列高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品;ZK-82B型真空干燥箱,上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠產(chǎn)品;KQ-500型超聲波清洗器,昆山市實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品;MP 21001 -電子天平,上海恒安科技儀器有限公司產(chǎn)品;FZI02型粉碎機(jī),河北省黃驊市新興電器廠產(chǎn)品。色譜甲醇,天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品;水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。 5批細(xì)辛藥材收集于通化縣內(nèi),分別為金斗、英額布、歡喜嶺、三顆榆樹與富江5地。經(jīng)通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定為北細(xì)辛藥材。藥品具體位置見圖1。

圖1 各樣品來源的具體位置

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1100 色譜柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸水溶液,按表1梯度洗脫;流速lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

考察了240, 254, 270, 287, 300, 316 nm檢測(cè)條件下的色譜圖,結(jié)果表明, 287 nm色譜圖峰形最好,出峰數(shù)目多,基線穩(wěn)定,各色譜峰相互之間分離度較好, 故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm[4]。

2.2.2 流動(dòng)相梯度的選擇

中藥指紋圖譜要求,所選定的色譜條件能夠盡量多的檢測(cè)出樣品的有效成分,即走出盡量多的色譜峰,并且分離度良好。本實(shí)驗(yàn)比較了8個(gè)不同的流動(dòng)相配比的梯度洗脫表程序?qū)Ρ奔?xì)辛的分離度,其中有代表性的5個(gè)梯度條件見表2。

表2 5個(gè)不同的梯度洗脫條件

按表2的流動(dòng)相配比及洗脫條件,經(jīng)若干次試驗(yàn)結(jié)果表明:在條件IV下出的色譜圖峰形最好,出峰數(shù)目多,基線穩(wěn)定,各色譜峰相互之間分離度也較好。見圖2。

圖2 在條件IV下檢測(cè)的北細(xì)辛樣品色譜圖

2.3 供試品溶液的制備

首先取5份50 g左右經(jīng)干燥過的樣品細(xì)辛,粉碎后過40目粒篩,然后分別精密稱取3 g,加50 mL甲醇,再密封超聲提取30 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜, 即可得到5 個(gè)地區(qū)的細(xì)辛的供試品溶液[4]。

2.4 細(xì)辛藥材的HPLC檢測(cè)

在條件IV下檢測(cè)上述5個(gè)供試品溶液,得到以下5個(gè)圖譜,見圖3～7。

2.5 細(xì)辛藥材指紋圖譜的建立

對(duì)此5個(gè)批次的供試品進(jìn)行檢測(cè),然后用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行計(jì)算,得到 S1～S5的指紋圖譜見圖8。圖中R為中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件生成的對(duì)照指紋圖譜,由虛線串連的峰為5批次樣品的共有色譜峰,共25個(gè)。

2.5.1 共有指紋峰的標(biāo)定

在25個(gè)共有色譜峰中,按峰面積的大小,選擇列前的6個(gè)峰作為指紋圖譜的強(qiáng)峰,這6個(gè)強(qiáng)峰的總面積占總峰面積的50%以上。以金斗地區(qū)的色譜峰作為參比峰,計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值。結(jié)果見圖9及表3, 4。

表3 6個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 6個(gè)共有指紋峰相對(duì)峰面積

由表3可看出, 6個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間一致性非常強(qiáng), 每個(gè)共有指紋峰的 RSD為0.0%～0.46%,說明該細(xì)辛指紋圖譜符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。從表4可以看出,在同一個(gè)品種中,各組分之間的含量比例比較穩(wěn)定, 除 2 號(hào)峰外, 極差在0.307 237～0.844 371之間。表明本試驗(yàn)所建立的細(xì)辛指紋圖譜不僅可以用作細(xì)辛的質(zhì)量檢測(cè)和控制,還可用于細(xì)辛的品種鑒別。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)

根據(jù)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件,對(duì)樣品S1～S5的HPLC色譜圖與進(jìn)行相似度分析,見表5。從表5中可以看出,除樣品S1外,樣品S2～S5與對(duì)照指紋圖譜R的相似度均大于0.85,符合指紋圖譜的要求。

表5 5批次細(xì)辛的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜R的相似度

3 討 論

本試驗(yàn)所建立的細(xì)辛HPLC指紋圖譜,其方法學(xué)考察結(jié)果表明該細(xì)辛的指紋圖譜符合國(guó)家中藥指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn),其中發(fā)現(xiàn)共有25個(gè)共有色譜峰,并標(biāo)定了其中占總峰面積50%的6個(gè)色譜峰為共有指紋峰。用于建立HPLC指紋圖譜的5批次樣品的相似度 0.771～0.941,相似度較高。本研究采用HPLC法對(duì)通化縣不同產(chǎn)地細(xì)辛藥材的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析,為全面控制藥材質(zhì)量提供了一定的研究基礎(chǔ)。從相似度分析結(jié)果中可以看出,產(chǎn)于通化縣部分地區(qū)的細(xì)辛藥材之間相似度較高, 說明近距離產(chǎn)地的細(xì)辛藥材之間存在的差異不大, 因此固定產(chǎn)地來源對(duì)保障細(xì)辛藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性極為重要。

[1]肖培根.新編中藥志:第三卷[M] .北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002:219.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M] .北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:185.

[3]洪筱坤, 王智華.中藥數(shù)字化色譜指紋圖譜[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2003:18.

[4]吳芳芳.北細(xì)辛提取物的血中移行成分分析[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 2008.