實時熒光定量 PCR構(gòu)建朊病相關(guān)蛋白 p38MAPK標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線

任 偉,楊利峰,趙德明

(1.北京市獸藥監(jiān)察所,北京 100107;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院國家海綿狀腦病實驗室,北京 100193)

傳染性海綿狀腦病(TSEs)也稱朊病,是由朊病毒引起的人和動物的一組神經(jīng)退行性疾病,其中包括牛瘋牛病(BSE)、人克雅氏病(CJD)和羊癢病(Scrapie)等。TSEs的發(fā)病機(jī)制目前仍以 Prusnier的朊蛋白學(xué)說為主,即體內(nèi)正常的富含 α-螺旋的PrPC轉(zhuǎn)變成致病性的富含 β-折疊的 PrPSc,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)聚集而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1]。朊病毒病的病理變化主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),包括腦海綿狀病變、神經(jīng)元空泡化、神經(jīng)元喪失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞激活[2]。

有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中一組主要的信號分子。迄今已證明該家族有 4個成員,即 ERK12,c-Jun N端激酶,p38MAPK,ERK 5/BMK1。它們存在于各類哺乳動物細(xì)胞中,能被多種生長因子、細(xì)胞因子及促分裂劑激活。其主要功能為促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的信號傳導(dǎo)。p38MAPK是 1993年發(fā)現(xiàn)的一類新的 MAPK通路,可以通過對細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞參與細(xì)胞對外界許多刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)。還能與細(xì)胞內(nèi)其他信號通路之間相互作用,是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)的交匯點或共同通路[3]。雖然p38MAPK在朊病中的具體作用仍不十分清楚,但有研究稱神經(jīng)細(xì)胞的死亡過程中 p38MAPK可能被激活。

因此,研究朊病感染模型小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a中 p38MAPK mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量,有助于進(jìn)一步揭示朊病毒誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。本研究成功構(gòu)建了實時熒光定量 PCR檢測小鼠 N2a細(xì)胞 p38MAPK基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線,為闡釋 p38MAPK基因在朊病誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的地位和作用奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系 N2a(ATCCCCL-131TM),購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物所;Trizol購自 Invitrogen公司;Reverse Transcriptase M-MLV購自 Promega公司;Trans5a感受態(tài)細(xì)胞、pEasy-T1、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix、2×PCR TaqMix、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實時熒光定量 PCR儀,OPTICON2型,MJResearch公司。

1.2 N2a細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 取出液氮罐中裝有N2a細(xì)胞的凍存管立即放入預(yù)熱至 37℃的水浴中并搖動,使管中細(xì)胞懸液融化后低速離心 5min 960 r/m in,離心后棄去凍存液,取 1 mL完全 DMEM加至管中反復(fù)吹打,吸出吹打后的液體加至培養(yǎng)瓶中,重復(fù)沖洗吹打一次。用含 10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基 4～5 mL調(diào)整細(xì)胞至所需濃度,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。 12～24 h待細(xì)胞貼壁后,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞總 RNA提取 用 0.1%DEPC水處理所有實驗用具(37℃,2 h),塑料器皿高壓滅菌,其他用品 180℃干烤 3 h。于 1.5mLEppendorf管總放入約 105細(xì)胞,加入 1m L Trizol用振蕩器充分振蕩混勻,使細(xì)胞充分裂解。冰浴 5 min。12 000 r/min離心 5 min,棄上清。加入 350μL氯仿,充分振蕩振搖 15秒或上下來回顛倒數(shù)次,靜置 15 min,12 000 r/m in離心 5min。吸取上層清亮的液相,移取 RNA水相至新的 1.5 mLEppendorf管,加入異丙醇,加入比例為 0.5mL/m LTrizol靜置,-20℃靜置30 min;4℃離心 12 000 r/min,10min。倒去上清,加入比例為 1m L75%酒精/mL Trizol;充分顛倒,洗滌 RNA沉淀 1次,7 500 r/min離心 10min。小心的吸取管中液體,風(fēng)干 5～10 min,加入無 RNA酶的 DEPC水 50μL溶解 RNA。參照 MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為 20μL。

1.4 小鼠 β-actin、p38MAPK部分基因片段的克隆 利用引物設(shè)計軟件 Primer Premier5.0,按照已經(jīng)發(fā)表的鼠相應(yīng) mRNA序列,分析并設(shè)計特異性引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。序列如下：上游 5'-ACTGCCAAGGAGCATCTA-3',下游 5'-GAAGAGCCTGACCTACAGT-3'。以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,反應(yīng)體系為總體積為 50μL,體系成分為：三蒸水 21μL;2×PCR TaqMix 25 μL;上下游引物各 1μL;cDNA 2μL。參數(shù)為：95 ℃,5min;94 ℃,30 s、55℃,30 s、72 ℃,30 s,35個循環(huán);72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后,以 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳驗證擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 按PCR產(chǎn)物回收試劑盒操作說明對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收。按pEASY-T1 Cloning Kit說明書,將純化產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接,連接體系為 5μL,其反應(yīng)組分為：pEASY-T1克隆載體 1μL、PCR產(chǎn)物 0.5～4μL,加滅菌三蒸水至總體積 5μL,加連接產(chǎn)物于50μL冰浴上融化的感受態(tài)細(xì)胞輕彈混勻,冰浴 30 min。42℃熱激 30 s,立即置于冰上 2min。加 250 μL平衡至室溫的 LB培養(yǎng)基,200 r/min,37℃孵育1 h。取 8μL,500 mM IPTG,40μL,20 mg/mL X-gal混合,均勻地涂于準(zhǔn)備好的 LB/Amp+培養(yǎng)基平板上,在 37℃放置 30 min。待 IPTG,X-gal被吸收后,取 200μL菌液加到平板上,將細(xì)胞均勻涂開,培養(yǎng)過夜。按全式金 PCR產(chǎn)物回收試劑盒操作說明進(jìn)行提取質(zhì)粒,并進(jìn)行質(zhì)粒 PCR和測序鑒定。

1.6 實時熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及定量分析 使用按照SYBR?Green Realtime PCRMaster Mix的使用說明,將質(zhì)粒稀釋成含有 103～108拷貝 /μL的 6個梯度,定量 PCR儀上擴(kuò)增,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 20μL real-time PCR反應(yīng)體系,按照下列反應(yīng)程序(見表 1)進(jìn)行設(shè)定。

表1 PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果

2.1 p38 MAPK基因擴(kuò)增重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以小鼠 N2a細(xì)胞的 cDNA為模板,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳,在預(yù)期大小處有一特異性條帶(圖 1),將擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化、插入T載體,質(zhì)粒提取,經(jīng) M13通用測序引物進(jìn)行自動測序后,利用 Blast軟件與 GenBank中相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明,成功的構(gòu)建了p38MAPK質(zhì)粒。

圖1 p38MAPK PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和直線回歸方程的確定 對β-actin、p38 MAPK、DR6重組質(zhì)粒按照 102～107倍比稀釋后,取 1μL各稀釋度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行real-time擴(kuò)增,系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程,結(jié)果如圖 2所示。結(jié)果表明,所有曲線回歸分析均存在一個高相關(guān)系數(shù)(r2=0.999),Tm值穩(wěn)定,峰值單一,沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的熔解峰,特異性較好。

圖2 p38MAPK標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和溶解曲線

3 討論

RT-PCR技術(shù)是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個 PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)以其敏感、特異、污染少、可定量、高通量等優(yōu)點而倍受青睞,常用的有 TaqMan探針法和 SYBR Green I染料法[4]。

結(jié)合染料 SYBR Green I是一種雙鏈 DNA結(jié)合染料,與雙鏈 DNA結(jié)合后,其熒光增強約 1 000倍,而不摻入鏈中的 SYBR染料分子僅有微弱熒光信號背景,熒光信號的增加與 PCR產(chǎn)物的增加同步。SYBR Green I染料法的優(yōu)勢在于能監(jiān)測任何雙鏈DNA序列的擴(kuò)增,不需設(shè)計探針,方法簡便,成本低,因此在核酸的檢測和定量中廣泛應(yīng)用[5]。

實時熒光定量 PCR準(zhǔn)確檢測樣品的前提是構(gòu)建重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和制定標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。在探究機(jī)體在正?；蚣膊》磻?yīng)過程中特定蛋白的 mRNA表達(dá)量變化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類研究中,如檢測免疫性滲出或炎癥部位細(xì)胞因子水平的推斷。盡管在結(jié)果分析時也要考慮 mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的偏差,但大量文獻(xiàn)報道 RT-PCR定量的特定蛋白 mRNA水平與 ELISA測定的該蛋白質(zhì)有良好的相關(guān)性。

朊病中 p38MAPk的作用仍存在爭議。通過研究 PrP106-126誘導(dǎo)人神經(jīng)瘤細(xì)胞系 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中的細(xì)胞信號變化發(fā)現(xiàn),PrP106-126可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡,并激活 caspase-3。p38MAPK的阻斷劑可以阻止神經(jīng)細(xì)胞的死亡。這一發(fā)現(xiàn)說明神經(jīng)細(xì)胞的死亡過程中 p38MAPK被激活。但 J.Carimalo等人在研究 PrP106-126導(dǎo)致小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系 N2a的過程中卻發(fā)現(xiàn),與 p38MAPK同屬于有絲分裂活化酶(JNK)家族中的 c-Jun氮端激酶是導(dǎo)致該神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要受體蛋白,而JNK-c-Jun通路在此過程中起到了至關(guān)重要的作用。同時,他還指出 N2a細(xì)胞凋亡過程中 p38激酶的作用并不明顯。基于本研究可以在分子水平上更好的闡明朊病發(fā)病過程中 p38MAPK的功能和作用,更好的揭示朊病的發(fā)病機(jī)理。

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[4] 溫立斌,何孔旺,楊漢春,等豬抗病毒蛋白基因重組質(zhì)粒實時熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,14(2)：124.

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