福建沿海臭鼩鼱感染巴爾通體調(diào)查研究*

臭鼩鼱(Suncusmurinus)屬食蟲目,鼩鼱科,常居于室內(nèi)外陰濕處,近年來福建沿海地區(qū)臭鼩鼱密度有上升趨勢,且局部地區(qū)已在鼠形動物中形成優(yōu)勢種群〔1〕。為了解福建沿海鼠形動物優(yōu)勢種群臭鼩鼱感染巴爾通體情況及分布,掌握臭鼩鼱作為保存宿主感染的巴爾通體種屬,2006～2008年,我們開展了福建沿海6市臭鼩鼱中巴爾通體流行狀況的調(diào)查并作基因特征分析,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)選擇 以福建省行政區(qū)劃為依據(jù)在沿海寧德、福州、莆田、泉州、廈門、漳州6地級市中各隨機(jī)抽取1個市(區(qū))作為調(diào)查點(diǎn),他們分別是蕉城區(qū)、福清市、荔城區(qū)、南安市、海滄區(qū)和龍海市。各調(diào)查點(diǎn)內(nèi)選擇不同地理景觀和不同生境作為鼠籠布放點(diǎn)。

1.2 樣本采集保存 各調(diào)查點(diǎn)于每年4～9月采用籠d法捕鼠,無菌狀態(tài)經(jīng)鼠股動脈采樣,液氮保存。1.3 培養(yǎng)與分離 分離方法參照美國報道方法〔2〕,并經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改良而來〔3〕,簡述如下：取血樣在1∶4BHI中稀釋液涂布于5%兔血瓊脂平板中,在5%CO2培養(yǎng)箱中36℃、RH85%中培養(yǎng)1～6W 后,可見圓形凸起,經(jīng)BASO劉氏染色后,在油鏡下,可見極其微小桿菌或球桿菌,作為疑似菌待作下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 PCR擴(kuò)增對可疑巴爾通體菌株,使用煮沸法提取染色體DNA,制成模板后,-20℃保存?zhèn)溆?。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)采用的引物是具有巴爾通體屬水平特異性的引物(BhCS781.p-BhCS1l37.n),擴(kuò)增枸櫞酸合酶基因(gltA)的379bp片段以證實(shí)是否巴爾通體。上游引物BhCS781.p堿基序列為：5'-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G-3',下游引物BhCS1l37.n堿基序列為：5'-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3'。PCR反應(yīng)體系總量為μ l,含以下成分：北京天為時代科技有限公司的Pfu MasterMixp 17μ l,正向、反向引物各 1μ l,模板1μ l。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃2min,48℃30s,72℃30s,再按94℃30s,48℃30s,72℃30s行30個循環(huán),72℃延伸5min結(jié)束。取 6μ l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糠凝膠經(jīng)80～100V 40min電泳,設(shè)標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker,50bp Ladde),陰性對照(用去離子水代替模板)。

1.5 序列分析 本研究設(shè)計(jì)引物TILE.455P-TALA.885.n擴(kuò)增產(chǎn)物為核苷酸序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測定。網(wǎng)上利用核苷酸序列對比程序BLAST2.0,與Genbank中注冊的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。用DNASTA軟件進(jìn)行雙序列同源性比對。用 Neighbor-Jouning tree(NJ)法建樹,采用Bootstrap驗(yàn)證(n=1000)。

2 結(jié) 果

2.1 臭鼩鼱在鼠形動物中構(gòu)成 本次調(diào)查共捕獲鼠形動物1161只,其中臭鼩鼱 294只,占 25.33%,與褐家鼠、黃胸鼠構(gòu)成福建沿海地區(qū)鼠形動物優(yōu)勢種群,見表1。

2.2 巴爾通體分離 2006～2008年,共從6個采樣點(diǎn)捕獲臭鼩鼱294只,從中分離出疑似菌株,經(jīng)PCR證實(shí),有63株為巴爾通體。巴爾通體細(xì)菌學(xué)性狀、gltA擴(kuò)增產(chǎn)物及電鏡形態(tài)見圖1～3。

2.3 地區(qū)及鼠間分布 臭鼩鼱感染巴爾通體,感染率21.43%,分布在福建沿海各地市中,見表2。且臭鼩鼱感染率(21.43%)高于黃胸鼠(18.27%)、褐家鼠(13.54%)及其它鼠種(10.87%),χ2=10.781,P＜0.05。見表3。

表1 福建沿海6市鼠形動物構(gòu)成(2005-2008年)Table 1 Constituent ratio of rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(2005-2008)

圖4 福建省沿海巴爾通體系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bartonella species from Fujian coastal region

2.4 基因特征與地域/宿主的關(guān)系

2.4 基因特征與地域/宿主的關(guān)系 在沿海6市(區(qū))63株臭鼩鼱巴爾通體菌株中隨機(jī)抽取19株作gltA基因的379bp片段序列測定。序列分析表明,巴爾通體感染臭鼩鼱明顯的種群分布特征和地域分布特征。福建省共從鼠形動物中檢出：B.elizabethae、B.qeenslandensis和B.tribocoram三種巴爾通體,而臭鼩鼱僅攜帶B.tribocoram種,且廈門海滄16株均感染B.tribocoramB亞群,福清1株感染B.tribocoramB亞群,而南安2株均感染B.tribocoramA亞群(圖 4)。

3 討 論

臭鼩鼱是南亞熱帶氣候區(qū)的主要鼠形動物之一,且隨著氣溫的提高,福建省近十年來臭鼩鼱的數(shù)量有明顯上升趨勢,每年的3～4、9～10月份占有絕對優(yōu)勢〔1〕。本調(diào)查雖未連續(xù)觀測臭鼩鼱的月動態(tài)變化,但其占室內(nèi)鼠形動物的25.33%,比重不小。因此,研究臭鼩鼱感染巴爾通體的流行狀況很有必要。

本文首次描述了臭鼩鼱感染巴爾通體的流行與分布特征,證實(shí)它是巴爾通體的保存宿主,從而填補(bǔ)了巴爾通體在食蟲目鼩鼱科動物中流行狀況的空白。從249份臭鼩鼱血樣中共分離到63株巴爾通體,分離率達(dá)21.43%,菌株在福建沿海各市(區(qū))臭鼩鼱均有分布,表明巴爾通體在臭鼩鼱廣泛存在,重度流行,預(yù)防控制巴爾通體應(yīng)將臭鼩鼱列入重點(diǎn)對象。

系統(tǒng)發(fā)育發(fā)析表明閩東南沿海臭鼩鼱巴爾通體僅為B.tribocoram種A、B兩個亞群,該型巴爾通體為Heller等〔4〕首先從法國褐家鼠分離得到,且地域分布特征明顯。本研究再次證實(shí)了此觀點(diǎn),海滄、福清17株均為Tirtocorum.B,而南安2株均為B.tribocoramA。有鑒于此,對于臭鼩鼱感染巴爾通體種型與地理景觀及其生存環(huán)境的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

(感謝蕉城區(qū)、福清市、荔城區(qū)、南安市、龍海市疾病預(yù)防控制中心同仁參加樣本采集。)

表2 福建沿海6市臭鼩鼱中巴爾通體感染的感染率Table 2 Infection rate of Bartonella in Suncus murinus from six investigated districts of Fujian coastal region(%)

表3 福建沿海6市鼠形動物巴爾通體感染率(2005-2008年)Table 3 Infection rate of Bartonella in rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(%)(2005-2008)

〔1〕周淑恒,陳亮,李述楊,等.福建臭鼩鼱種群數(shù)量分布調(diào)查〔J〕.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,9(5)：37-38.

〔2〕Kosoy M,regnery R,T sianbosT,et al.Distribution,diversity and host specity ofBartonallain rodents from the southeastern United States〔J〕.Am J Trop Med Hyg,1997,57 ：578-588.

〔3〕葉曦,姚美琳,李國偉.福建省鼠形動物巴爾通體感染調(diào)查〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2006,22(8)：779-781.

〔4〕Heller R,Rieg ler P,Hansmann Y,et al.Bartonella tribocoramsp.nov,a newBartonellaspecies is olated from the blood of wild rats〔J〕.International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48：1333-1339.