生長抑素對高脂日糧誘導(dǎo)小鼠肥胖和氧化應(yīng)激的影響

李 武，施用暉，2，崔 玨，肖 瀛，樂國偉，2

(1 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122;2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

生長抑素(Somatostatin，SS)作為一種對消化吸收功能起抑制性調(diào)節(jié)的激素，抑制各種胃腸激素的釋放，抑制胃酸、胃蛋白酶、胰液的分泌，減少食物的消化吸收［1］.在畜牧生產(chǎn)中常利用半胱胺耗竭SS以促進(jìn)動(dòng)物的生長［2］.但是高能膳食和食物攝入本身會(huì)增加機(jī)體活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成［3-4］.ROS過量生成會(huì)擾亂正常的ROS信號通路，引起氧化應(yīng)激以致對機(jī)體造成損害［5］.SS對消化吸收功能的抑制作用可能對食物攝入過程中ROS生成起到調(diào)節(jié)作用，從而對機(jī)體起到保護(hù)作用.本文通過高脂日糧誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物肥胖模型，研究SS變化在高脂日糧誘導(dǎo)的肥胖和氧化應(yīng)激產(chǎn)生過程中的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 80只雄性C57BL/6小鼠(5周齡，體質(zhì)量16～18 g)購自上海試驗(yàn)動(dòng)物中心斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物公司.

1.1.2 試劑 環(huán)生長抑素(Cyclosomatostatin，CSS)購自 Sigma公司;醋酸奧曲肽注射液(Octreotide，OCT，瑞士諾華制藥公司生產(chǎn))購自無錫第四人民醫(yī)院;辣根過氧化物酶(HRP)、魯米諾(luminal)購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、總抗氧化能力(TAC)測定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司;葡萄糖測定試劑盒、甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒購自北京中生北控生物科技公司;膽汁酸測定試劑盒購自寧波亞太生物技術(shù)公司;生長抑素(SS)放射性免疫試劑盒、胰島素(INS)放射性免疫試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法 80只 C57BL/6小鼠，同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由采食和飲水.環(huán)境溫度(23±2)℃，濕度60%.預(yù)飼7 d，隨機(jī)分成2組:正常日糧組［w(脂肪)為4.89%］16只;高脂日糧組［w(脂肪)為21.45%］64只.日糧按AIN-76小鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制［6］.飼喂28 d后，正常日糧組隨機(jī)分成2組.每組8只，高脂組按體質(zhì)量由大到小分類，前25%［7］共16只記為高脂日糧誘導(dǎo)肥胖組，再隨機(jī)分成2組，繼續(xù)飼喂10 d，并于每天08:00—08:30腹腔注射相應(yīng)試劑，處置如下:正常日糧組:①生理鹽水0.1 mL，記為 NC(normal control)組;②CSS 0.1 mL(劑量 1 μg·kg－1)，記為 NC+CSS 組.高脂日糧誘導(dǎo)肥胖組:①生理鹽水0.1 mL，記為DO(HFD-induced obesity group)組;②OCT 0.1 mL(劑量20 μg·kg－1)，記為DO+OCT組.(藥物的注射劑量和時(shí)間依據(jù)藥物說明書、文獻(xiàn)［8］等，并通過預(yù)試驗(yàn)確定).各組在注射的第10 d后均灌胃乳化豬油0.2 mL，于灌胃后1.5 h，取血，斷頸處死，取相應(yīng)組織，冰浴上制備組織勻漿，測定相應(yīng)指標(biāo).

1.2.2 胃酸、血總膽汁酸和脂肪酶的測定 收集胃液，8000 r·min－1離心 10 min，上清液用 0.01 mol·L－1NaOH滴定，測定胃液總酸度，結(jié)果以氫離子濃度［c(H+)/(mmol·L－1)］表示.腸脂肪酶活性采用橄欖油乳濁液比濁法測定，以37℃條件下，1 min能催化分解1 μmol底物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)，其結(jié)果表示成活力單位每毫克組織蛋白(U·mg－1).膽汁酸采用3-α羥類固醇脫氫酶法測定，按寧波亞太生物技術(shù)公司膽汁酸測定試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.3 血糖(GLU)、血脂、生長抑素和胰島素(INS)的測定 血糖、TG、TC、HDL-C和LDL-C使用北京中生北控生物科技公司相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定.生長抑素、胰島素使用北京華英生物技術(shù)研究所相應(yīng)放射性免疫試劑盒進(jìn)行測定(生長抑素測定試劑盒所使用抗體與OCT、CSS交叉反應(yīng)性為0).

1.2.4 活性氧的測定 ROS測定使用魯米諾化學(xué)發(fā)光法［3］.50 μL 組織勻漿稀釋于 830 μL HEPES(pH7.4)緩沖液中，加入20 μL HRP(12 U·mL－1)，置于MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀反應(yīng)室內(nèi)，注入100 μL 魯米諾(5 mmol·L－1)啟動(dòng)反應(yīng).結(jié)果表示成儀器記錄發(fā)光曲線下面積(area under curve，AUC)每毫克組織蛋白.

1.2.5 超氧化物歧化酶、總抗氧化能力、丙二醛的測定 SOD、TAC和MDA均使用南京建成生物技術(shù)公司相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定.其中SOD活力使用黃嘌呤氧化酶法測定，通過檢測測定體系中亞硝酸鹽(超氧陰離子氧化羥胺形成亞硝酸鹽)形成的抑制程度，計(jì)算出被測樣品的SOD活力.其酶單位定義為:37℃條件下，每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U).TAC根據(jù)樣品中抗氧化物質(zhì)使Fe3+還原成Fe2+，后者可與啡啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過比色測定其抗氧化能力的高低.其單位定義為:37℃條件下，每分鐘每毫克組織蛋白，使反應(yīng)體系的光密度每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位(U).MDA含量測定依據(jù)MDA與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，通過標(biāo)準(zhǔn)品(試劑盒中提供)的光密度計(jì)算出樣品中MDA的含量.以上指標(biāo)結(jié)果均表示成活性單位每毫克組織蛋白(U·mg－1或 nmol·mg－1).

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.文中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.以ANOVA方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和差異顯著性檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為相差顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量、腹脂量和采食量的變化

表1結(jié)果顯示，DO組體質(zhì)量、腹脂量(用每克體質(zhì)量中腹脂的質(zhì)量表示)顯著高于NC組，OCT可以降低其(DO+OCT組)體質(zhì)量和腹脂量.對于正常日糧組，SS拮抗劑CSS顯著增加其(NC+CSS組)體質(zhì)量.

表1 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠體質(zhì)量、腹脂量和采食量的影響1)Tab.1 Changes in body mass，adipose tissue mass，and food intake in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

2.2 胃酸、膽汁酸和脂肪酶的變化

表2結(jié)果顯示，DO組膽汁酸和脂肪酶水平均顯著高于NC組，胃酸水平比NC組也有所升高.說明高脂日糧飼喂可誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物對食物的消化能力增強(qiáng).OCT顯著降低DO組胃酸、膽汁酸水平.與NC組相比，NC+CSS組胃酸和膽汁酸水平有所升高，分別提高115.2%和128.5%，脂肪酶水平也提高132.3%(P＜0.05).表明SS生理功能的降低，會(huì)引起機(jī)體對食物消化能力的增強(qiáng).

表2 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠胃酸、膽汁酸和脂肪酶的影響1)Tab.2 Changes in gastric acidity，total bile acid，and lipase activity of duodenum in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

2.3 血糖和血脂代謝的變化

表3結(jié)果顯示，DO組表現(xiàn)出明顯的糖、脂代謝紊亂.DO組血糖、胰島素水平顯著高于正常日糧組.注射OCT降低DO組血糖、胰島素水平.各組之間TC水平?jīng)]有顯著差異.注射CSS顯著升高正常日糧組LDL-C(132.2%，P＜0.05)水平.DO組 TG、LDLC水平顯著高于正常組，HDL-C水平顯著低于正常組.OCT降低DO組TG(86.5%)、LDL-C(78.9%，P＜0.05)水平，升高HDL-C(141.1%，P＜0.05)水平.以上結(jié)果表明SS生理功能的增強(qiáng)可以改善高脂日糧誘導(dǎo)產(chǎn)生的試驗(yàn)動(dòng)物血糖、血脂代謝紊亂.

表3 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠血糖和血脂的影響1)Tab.3 Changes in blood glucose and lipid levels in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

2.4 血漿生長抑素水平的變化

圖1結(jié)果顯示，高脂日糧導(dǎo)致DO組SS水平顯著降低，OCT可以顯著提高DO組SS水平.

2.5 各消化器官ROS水平的變化

圖2結(jié)果顯示，DO組胃、十二指腸、肝臟、胰腺各消化器官ROS水平高于正常日糧組.OCT注射降低DO組胃(84.1%)、十二指腸(60.8%，P＜0.05)、肝臟(78.2%，P＜0.05)、胰腺(78.6%)ROS水平.而CSS注射升高正常日糧組胃(165.2%，P＜0.05)、十二指腸 (118.1%)、肝臟 (114.3%)、胰腺(146.5%，P＜0.05)ROS水平.結(jié)合圖1 DO組SS水平顯著降低的結(jié)果表明，高脂日糧誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物餐后ROS生成增加與其SS水平降低有關(guān).

圖1 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠血漿生長抑素(SS)水平的影響Fig.1 Changes in plasma somatostatin(SS)levels in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

圖2 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠消化器官ROS水平的影響Fig.2 Changes in ROS levels of digestive system in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

2.6 抗氧化指標(biāo)的變化

表4結(jié)果顯示，DO組胃、十二指腸、肝臟、胰腺各消化器官SOD、TAC水平均顯著低于NC組.OCT注射提高DO組消化器官SOD、TAC水平.CSS注射降低正常日糧組胃、十二指腸、肝臟、胰腺SOD、TAC水平.

DO組胃、十二指腸、肝臟、胰腺各消化器官M(fèi)DA水平均顯著高于NC組.OCT注射降低DO組胃(84.8%)、十二指腸(65.4%，P ＜0.05)、肝臟(81.8%，P＜0.05)、胰腺(81.4%)MDA水平.CSS注射引起正常日糧組十二指腸、胰腺M(fèi)DA水平顯著升高.

表4 生長抑素類似物與拮抗劑對小鼠消化器官抗氧化指標(biāo)的影響1)Tab.4 Changes in antioxidant index of digestive system in control and HFD-induced obesity group(DO)mice treated with agents

3 討論

高能膳食增加機(jī)體的能量攝入水平，一方面，過多的能量物質(zhì)在體內(nèi)形成脂肪得以貯存，大量脂肪的堆積會(huì)引發(fā)肥胖;另一方面，攝入的食物在生成能量的同時(shí)也不斷產(chǎn)生ROS［3-4］.Matsuzawa-Nagata等［9］研究表明，高脂日糧誘導(dǎo)動(dòng)物氧化應(yīng)激的產(chǎn)生要早于其肥胖、胰島素抵抗的發(fā)生.ROS的過量生成與胰島素抵抗［10］、代謝綜合征［11］、心血管疾病［12］的發(fā)生有著直接的關(guān)系.本文的試驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂日糧誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物出現(xiàn)的胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激伴隨著其SS水平的降低.而注射SS類似物OCT可以降低其灌胃油脂后ROS水平，改善上述指標(biāo).同時(shí)，對于正常日糧飼喂動(dòng)物，SS功能的降低(NC+CSS組)引起正常日糧組灌胃油脂后機(jī)體ROS水平升高，抗氧化系統(tǒng)功能降低，體質(zhì)量增加.這些結(jié)果表明，機(jī)體SS水平變化影響消化吸收過程中的ROS生成，SS水平的降低在高脂日糧誘導(dǎo)動(dòng)物肥胖和氧化應(yīng)激產(chǎn)生過程中起著重要的作用.所以，SS的生理功能不只是抑制食物的消化吸收，其可以通過對消化吸收過程的抑制性調(diào)節(jié)，減少機(jī)體ROS生成，從而在高能壓力或食物消化吸收過程中對機(jī)體起到保護(hù)作用.這一發(fā)現(xiàn)可能為肥胖、代謝綜合征等相關(guān)營養(yǎng)性代謝疾病的產(chǎn)生機(jī)制以及治療提供新的理論基礎(chǔ)與依據(jù).

高脂日糧誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)高膽汁酸、高脂肪酶，表現(xiàn)為對食物的消化吸收能力增強(qiáng)，餐后高血糖、血脂水平.SS通過對消化吸收過程的抑制性調(diào)節(jié)，減少機(jī)體對食物的消化吸收，降低機(jī)體能量攝入水平［1］.本文的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，OCT注射降低試驗(yàn)動(dòng)物胃酸、膽汁酸分泌，減少高脂日糧誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加.同時(shí)，SS拮抗劑CSS引起正常日糧飼喂動(dòng)物的體質(zhì)量增加，這表明DO組SS水平的降低與其體質(zhì)量的增加有直接關(guān)系.

本文的試驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂日糧誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)灌胃后高血糖、高TG、高LDL-C、低HDL-C血脂紊亂現(xiàn)象.而高的血糖、血脂水平會(huì)增加機(jī)體ROS生成［5，13］.ROS 過量生成會(huì)通過激活 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase)等途徑抑制胰島素信號通路，產(chǎn)生胰島素抵抗［10，13］，胰島素抵抗會(huì)引起機(jī)體血糖、血脂水平的進(jìn)一步升高，從而形成惡性循環(huán).過量的ROS生成會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸結(jié)構(gòu)的改變，增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體損傷［5］.試驗(yàn)結(jié)果也顯示，高脂日糧動(dòng)物灌胃后ROS生成增加，機(jī)體抗氧化能力降低，MDA水平增加.SS對消化吸收過程的抑制性調(diào)節(jié)，可能同時(shí)也減少了機(jī)體ROS的生成.研究顯示，SS類似物奧曲肽可以降低藥理試劑誘導(dǎo)的試驗(yàn)動(dòng)物脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成［14］.本文的結(jié)果顯示:OCT可以提高高脂日糧誘導(dǎo)肥胖組抗氧化能力，降低其ROS生成和MDA水平;CSS引起正常日糧組動(dòng)物抗氧化能力降低，ROS生成增加，機(jī)體MDA水平升高.這些結(jié)果表明，SS水平降低在高脂日糧誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物肥胖、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生過程中起著重要的作用.

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