產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌株 Z1發(fā)酵條件優(yōu)化

胡青平

(山西師范大學(xué)生命學(xué)院,臨汾 041004)

產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌株 Z1發(fā)酵條件優(yōu)化

胡青平

(山西師范大學(xué)生命學(xué)院,臨汾 041004)

以本實(shí)驗(yàn)室分離的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌株 Z1為研究對(duì)象,采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、方差分析和多重比較,研究了碳源、氮源、溫度、初始 pH等因素對(duì) Z1菌株產(chǎn)纖維素酶活力的影響,確定了其產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件組合。結(jié)果表明,在此試驗(yàn)范圍內(nèi),影響 CMC酶的主次因素由大到小依次為碳源、氮源、pH;影響FPA酶的主次因素由大到小依次為 pH、碳源、氮源。菌株 Z1的最優(yōu)發(fā)酵條件為 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉3 g,pH為 7.0。在此條件下,不僅有較高的纖維素酶活,同時(shí)還有較高的蛋白酶活,即 CMC酶活力 132.5 μg/(mL·min),FPA酶活力 93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。

纖維素酶 細(xì)菌 發(fā)酵條件

纖維素酶是降解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵,使纖維素分解成纖維二糖、葡萄糖等可溶性糖的一組酶的總稱(chēng)。該酶己在紡織、日用化工、造紙、食品發(fā)酵加工工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,并受到各國(guó)生物界的關(guān)注,期望借助纖維素酶將地球上最廉價(jià)、最豐富的可再生資源 -纖維素,轉(zhuǎn)化為能直接利用的能源和資源[1-5]。目前纖維素資源的利用率不僅低,而且對(duì)環(huán)境會(huì)造成一定的污染。因此,如何成功的開(kāi)發(fā)這一資源,對(duì)解決人類(lèi)面臨的能源問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題、可持續(xù)發(fā)展都具有非常重要的意義[6]。

利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)分解和轉(zhuǎn)化纖維素則是纖維素利用的有效途徑[7]。一直以來(lái),纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)都以真菌為主。但真菌纖維素酶的適宜 pH值多為酸性,工業(yè)應(yīng)用步驟繁瑣,在很大程度影響了纖維素的酶解效率[8-9]。近年來(lái),隨著細(xì)菌產(chǎn)生的中性和堿性纖維素酶在工業(yè)中的成功應(yīng)用,細(xì)菌纖維素酶制劑已逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。但細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量較少,主要是葡聚糖內(nèi)切酶,大多數(shù)對(duì)結(jié)晶纖維素?zé)o降解活性,且所產(chǎn)生的酶大多是胞內(nèi)酶或吸附在細(xì)胞壁上,不分泌到培養(yǎng)液中,增加了提取純化的難度,因此對(duì)細(xì)菌的研究較少。本試驗(yàn)的研究對(duì)象是從自然環(huán)境中分離、純化和培養(yǎng)了的一株經(jīng)剛果紅顯色法鑒定的高效纖維素分解細(xì)菌菌株 Z1,同時(shí)還有產(chǎn)蛋白酶的性能。采用正交設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合,優(yōu)化了 Z1菌株的發(fā)酵條件,為進(jìn)一步的生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供可能的發(fā)酵模式和新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

山西師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離的一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌株,該菌形態(tài)桿狀,可產(chǎn)芽孢,適宜在 pH值 7.0～9.0、35～40℃條件下生長(zhǎng),為便于研究,將其命名為 Z1。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌種保藏培養(yǎng)基 (g/L)[10]

蛋白胨 10 g,牛肉膏 3 g,NaCl 1 g,瓊脂 20 g,pH為 7.0,121℃滅菌 20 min。

1.2.2 CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基 (g/L)[11]

CMC-Na 1.88 g,剛果紅 0.2 g,硫酸銨 3 g,瓊脂 20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,K2H PO41 g,pH為 7.0,121℃滅菌 20 min。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)[10]

CMC 3.0 g,蛋白胨 5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,酵母粉 5 g,pH為 7.0, 121℃滅菌 20 min。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HPX-9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;BS-2F數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱:常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠;7200可見(jiàn)分光光度計(jì):龍尼柯儀器有限公司。

1.4 菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶能力定性分析

將實(shí)驗(yàn)室已分離的纖維素酶菌 Z1三點(diǎn)接種于CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基,在 35℃的培養(yǎng)箱里放置3 d。觀察透明圈的有無(wú)和大小。

1.5 產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化

分別改變液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源 (玉米粉、CMC)、氮源(豆餅粉、蛋白胨),并以?xún)煞N碳源的復(fù)配克數(shù) (3.0+0、2.0+1.0、1.5+1.5、1.0+2.0、0+ 3.0 g/L)、豆餅粉 (1、3、5、7、9 g/L)、發(fā)酵溫度 (25、30、32、35、37、40℃)和初始 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)為 4個(gè)單因素試驗(yàn),搖床培養(yǎng) 72 h。測(cè)定各單因素條件下初酶液的CMC酶活力和 FPA酶活。然后選擇其中三個(gè)因素 (碳源、氮源和 pH),采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)[12],以 CMC酶、FPA酶及蛋白酶活為衡量指標(biāo),研究三因素對(duì)產(chǎn)酶的主次影響。統(tǒng)計(jì)分析軟件為DPS v3.01。

1.6 初酶液的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng) 35℃,220 r/min搖床培養(yǎng)72 h,發(fā)酵液用 4層紗布過(guò)濾,3 000 r/min離心15 min,取上清液備用。

1.7 纖維素酶活測(cè)定

CMC酶活力和 FPA酶活力的測(cè)定均用 DNS法[9],包括葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。另 CMC酶作用底物用CMC-Na,FPA酶作用底物為濾紙條。酶活力定義參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003。

1.8 蛋白酶活測(cè)定

參照丁魯華等[13]測(cè)定蛋白酶活力的方法。1.0 mL酶液于40℃,pH 7.2條件下,每分鐘水解2%酪蛋白溶液產(chǎn)生1 g酪氨酸的量定義為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶能力的定性分析

圖1 產(chǎn)纖維素酶菌株的定性分析

將 Z1菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果見(jiàn)圖 1。由于剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物,而不能與水解后的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復(fù)合物,所以在產(chǎn)纖維素酶菌株周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)透明圈,通過(guò)測(cè)量其透明圈的直徑(1.7±0.4)cm。故 Z1是一株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

分別改變 Z1菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、初始培養(yǎng) pH和發(fā)酵溫度,控制其他條件不變,搖床培養(yǎng) 72h。各處理的纖維素酶活力見(jiàn)表 1、圖 2、圖3、圖 4和圖 5。

表1 碳、氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響

從表1可知,各處理中 CMC酶活力均高于 FPA酶活,且玉米粉和CMC對(duì) CMC酶活力和 FPA酶活力的影響均無(wú)顯著差異(P>0.05),而纖維素酶屬誘導(dǎo)酶,故在后續(xù)試驗(yàn)中考慮用玉米粉和 CMC的復(fù)配提高纖維素酶活;豆餅粉和蛋白胨對(duì)纖維素酶活的影響也無(wú)顯著性差異 (P>0.05),為了低成本、更有效的服務(wù)于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn),故選用豆餅粉為氮源。

從圖 2可知,CMC和玉米粉復(fù)配對(duì)纖維素酶活有一定的影響,其復(fù)配克數(shù)為 (2+1)g/L時(shí),CMC酶活力和FPA酶活力都達(dá)到最高;從圖 3可知,當(dāng)豆餅粉為 5 g/L時(shí),有較高的 CMC酶活力和 FPA酶活力;從圖 4可知,初始 pH為 6.5～7.5時(shí), CMC酶活力較高,初始 pH為 7.0,FPA酶活力最高;從圖 5可知,小范圍的溫度變化會(huì)引起纖維素酶的大幅度變化,因此,在后續(xù)正交試驗(yàn)中,固定發(fā)酵溫度為 35℃。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,保持發(fā)酵溫度不變(35℃),采用 L9(34)正交試驗(yàn)的方法,研究氮源 (豆餅粉)、CMC和玉米粉的復(fù)配比例、pH三個(gè)因素對(duì)產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)蛋白酶的影響。確定其發(fā)酵的主次因素及相互關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表 2、表 3和表4。

表2 菌株 Z1正交試驗(yàn)

表3 方差分析

從表2中極差R可知,以 CMC酶活力為衡量指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序及最優(yōu)組合為:B2A2C2,且各處理的 CMC酶活力間沒(méi)有顯著性差異 (P> 0.05)。以 FPA酶活力為衡量指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序及最優(yōu)組合為:C2B2A1,且各處理的 FPA酶活力間有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明各因素的水平間不能相互替換。以蛋白酶活為衡量指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序?yàn)?B2A2C2,且各處理的蛋白酶活沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。從表 3方差分析和表 4的 SSR多重比較得知,B因素的三水平對(duì)三種酶活力的影響均有顯著性差異 (P<0.05),而 C因素的水平只對(duì)FPA酶活力有顯著性差異 (P<0.05)。綜合以上分析,首先可以確定的因素水平為 C2B2。對(duì)于A因素,對(duì)于CMC酶活力和蛋白酶活來(lái)說(shuō),需選2水平,但考慮到降低成本,我們選用A因素的 1水平,且B2C2A1組合下發(fā)酵的三類(lèi)酶活力均處于較高的水平,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉 3 g,pH為 7.0的條件下發(fā)酵時(shí),CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL· min)。

表4 SSR檢驗(yàn)

3 結(jié)論

主要研究了不同氮源、碳源、不同初始 pH及不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶活的影響,并通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)得出了最優(yōu)發(fā)酵條件組合,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉 3 g,pH為 7.0的條件下發(fā)酵時(shí),CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。試驗(yàn)所確定的 Z1菌株的最優(yōu)條件組合可以為該菌株的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶蛋白酶提供了一定的理論依據(jù)。

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Opti mization of Fer mentation Conditions for Cellulase High-Yield Bacteria Z1

Hu Qingping
(College ofLife Science,ShanxiNormalUniversity,Linfen 041004)

Taking cellulase high-yield strain Z1 from our laboratory as object,the fermentation conditions for strain Z1were optimized.Single factor tests,orthogonal experimental designs,variance analysis and multiple comparisonswere applied to study the effects of influencing factors,carbon source,nitrogen source,temperature and pH,and to op2 timize the fermentation parameters.Results:The effect sequences of three main factors for CMC enzyme activity rank from pri mary to secondary as carbon source,nitrogen source,and pH,and for FPA enzyme activity as pH,carbon source,and nitrogen source.The optimal fer mentation conditions for strain Z1 are CMC 2 g,corn flour 1 g,soybean meal powder 3 g,pH 7.0.Under the optimal fer mentation conditions,strain Z1 has not only high cellulase activity but also high protease activity,i.e.,C MC enzyme activity 132.5μg/(mL·min),FPA enzyme activity 93.8μg/(mL·min) and protease activity 46.7μg/(mL·min).

cellulase,bacteria,fermentation conditions

Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)09-0111-05

山西省青年基金 (2008021040),山西省軟科學(xué)項(xiàng)目(2010041031-02),山西師范大學(xué)自然基金 (ZR0 9015)

2009-07-15

胡青平,女,1972年出生,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,微生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用