桑蠶蛹中高純度α－亞麻酸的分離研究

魯仲輝潘秋月孟祥河孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院1，杭州 310014)

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系2，杭州 310018)

桑蠶蛹中高純度α－亞麻酸的分離研究

魯仲輝1潘秋月2孟祥河1孫培龍1

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院1，杭州 310014)

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系2，杭州 310018)

為獲得高純度蠶蛹α－亞麻酸，研究采用了尿素脂肪酸包合結(jié)合銀離子硅膠色譜技術(shù)分離。結(jié)果表明，脂肪酸/尿素質(zhì)量比對包合效果的影響最重要，尿素濃度、結(jié)晶溫度和時(shí)間的影響其次。當(dāng)脂肪酸/尿素(質(zhì)量比)為0.3，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，0℃結(jié)晶2 h，α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從初始的32.53%提高到83.56%。二次尿素結(jié)晶包合提高α－亞麻酸純度的效果并不明顯，反而α－亞麻酸回收率明顯下降。對一次包合富集的產(chǎn)物采用銀離子硅膠色譜柱進(jìn)一步純化，α－亞麻酸純度提高至近100%，回收率86.2%。因此采用尿素包合結(jié)合銀離子硅膠色譜分離高純度蠶蛹α－亞麻酸是可行的。

α－亞麻酸 桑蠶蛹 純化 尿素包合 銀離子色譜

α－亞麻酸(ALA)即9c，12c，15c—十八碳三烯酸，作為ω3系多不飽和脂肪酸具有顯著的藥理作用和營養(yǎng)價(jià)值［1－2］。此外，α－亞麻酸是人體必需脂肪酸，只能從外源食物中攝取。體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)，在降血脂、降血壓、抗血栓、抗癌、抗過敏等方面都可發(fā)揮重要作用［3－4］。目前，α－亞麻酸在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。主要來源于紫蘇油、黑加侖籽油、胡麻籽油、亞麻籽油、接骨木油等小油料。上述原料的主要問題是或產(chǎn)量低或來源不穩(wěn)定，因而成本較高。蠶蛹作為桑蠶業(yè)繅絲副產(chǎn)物，產(chǎn)量大，成本低，來源穩(wěn)定，其蛹油中α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，是較為經(jīng)濟(jì)的α－亞麻酸原料。本研究采用尿素包合法結(jié)合銀離子絡(luò)合色譜技術(shù)分離高純度的α－亞麻酸。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑蠶蛹:浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院;脂肪酶:無錫雪酶酶制劑有限公司;亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司;硅膠(100～120目，表面積127.85 m2/g):青島海洋化工廠分廠;其他試劑均為分析純。

KQ－300GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波反應(yīng)器:昆山超聲儀器廠;刮膜式分子蒸餾設(shè)備:美國Pope公司;6890 GC配氫火焰離子化檢測器:美國Agilent公司;SP－2340鍵合硅膠毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm，i.d.0.2 μm):美國Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹油萃取

取新鮮蠶蛹真空干燥(70℃，13.33 kPa，2～3 h)，使含水量小于8%，然后破碎至100目。用正己烷(料液比1∶15)超聲波輔助萃取20 min，過濾取清液。重復(fù)萃取2次合并萃取清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶劑至恒重得試驗(yàn)用油，粗脂肪得率30%。

1.2.2 蛹油混合脂肪酸的制備

稱取適量蠶蛹油，配成20%的水溶液，水浴預(yù)熱至40℃，加入油質(zhì)量5%的脂肪酶，水浴中攪拌(500 r/min)水解5 h，定期測水解度。結(jié)束后過濾，靜置分相。油相用0.8%氯化鈉水溶液洗3次，然后無水硫酸鈉干燥，最后分子蒸餾(真空度30～50 Pa，190℃)除雜質(zhì)，取輕相作為后續(xù)尿素包合的原料。蠶蛹油水解率為95.3%，蒸餾后的混合脂肪酸組成與原料基本相同。

1.2.3 尿素包合方法

將尿素加入一定量乙醇中，65℃水浴中攪拌溶解，按比例加入一定量混合脂肪酸，20～30 r/min攪拌30 min，取出冷至室溫。于設(shè)定溫度下包合一定時(shí)間，取出后迅速減壓抽濾，用少量包合溫度下的冷乙醇洗滌結(jié)晶，濾液用10%鹽酸調(diào)至pH 2.5，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷30 mL萃取，棄水層，重復(fù)萃取兩次，合并油相水洗至中性，然后無水硫酸鈉干燥，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶劑，最后氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確稱重，得到富集的α－亞麻酸。α－亞麻酸回收率根據(jù)富集物中亞麻酸占起始原料亞麻酸質(zhì)量的百分比計(jì)算。

1.2.4 銀離子色譜絡(luò)合吸附亞麻酸的方法

50 g硅膠分散在乙醇中(20 mL，10 min)，加入150 mL硝酸銀乙醇溶液(5 g硝酸銀溶于150 mL 70%乙醇中)連續(xù)攪拌10 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下水浴蒸干乙醇，然后80℃干燥過夜，激活銀離子硅膠，得到自由流動(dòng)的吸附銀離子的硅膠粉末。冷卻盛于棕色瓶中干燥保藏。濕法裝柱(玻璃色譜柱19 mm×30 cm，填充高度5 cm。取1.0 mL混合脂肪酸乙脂，溶于5 mL正己烷中，加入吸附柱，先用50 mL正己烷洗脫除去未被吸附的脂肪酸和飽和脂肪酸，然后用正己烷/丙酮(99∶1)洗脫單不飽和脂肪酸，最后用50 mL丙酮洗脫亞麻酸，流速2 mL/min。每50 mL收集一個(gè)餾分，GC分析 α－亞麻酸含量，計(jì)算回收率。

1.2.5 脂肪酸組成的GC法分析

混合脂肪酸甲酯化采用BF3/甲醇法。甲酯分析采用安捷倫6890系列GC/FID檢測，SP－2340鍵合硅膠毛細(xì)管柱，180℃恒溫30 min。進(jìn)樣口及檢測器溫度分別為220℃和245℃，載氣He，1.5 mL/min，分流比1∶30。各脂肪酸的含量采用歸一化法。每個(gè)樣品獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸/尿素對包合效果的影響

尿素包合物的形成與脂肪酸的本質(zhì)有關(guān)。脂肪酸飽和度越高、碳?xì)滏溤介L，越容易與尿素分子結(jié)合形成六菱形包合物。因此包合時(shí)，直鏈飽和的棕櫚酸、硬脂酸容易形成包合物，而多不飽和脂肪酸如亞油酸、α－亞麻酸則在溶液中富集。因此包合后通過簡單的過濾就可實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的分離。然而，要得到較好的包合分離效果，適宜的脂肪酸/尿素質(zhì)量比是重要的。不同脂肪酸/尿素條件下(尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，包合溫度為4℃，時(shí)間為12 h)富集得到的脂肪酸組成及亞麻酸回收率分別如圖1和圖2所示。

圖1 不同脂肪酸/尿素下富集產(chǎn)物的脂肪酸組成

顯而易見，隨脂肪酸/尿素增加，尿素量逐漸不足以包合混合脂肪酸中的飽和脂肪酸，因此產(chǎn)物中亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降明顯(從87.92%降為44.18%)。就產(chǎn)物純度來講，脂肪酸/尿素為0.1時(shí)效果最好，此時(shí)棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從原料中的22.42%、5.73%、32.79%分別降到1.01%、0.29%、4.29%，亞油酸含量變化不大(由4.37%降至4.29%)，多不飽和脂肪酸α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則從32.53%驟增至87.92%。但由于尿素過量，部分多不飽和脂肪酸也與尿素結(jié)合形成復(fù)合物，因此α－亞麻酸回收率僅為38.4%。包合物中的脂肪酸通過范德華力、色散力或靜電相互作用與尿素結(jié)合維持穩(wěn)定，包合物的形成完全取決于脂肪酸的性狀、大小和幾何形狀［5］。α－亞麻酸的回收率趨勢則與純度不同，前期隨脂肪酸/尿素增大而增加，脂肪酸/尿素為0.6時(shí)，α－亞麻酸回收率最高達(dá)94%，但α－亞麻酸純度僅為52%。脂肪酸/尿素進(jìn)一步增加，α－亞麻酸回收率、純度均下降。這可能是由于脂肪酸載荷過大，結(jié)晶時(shí)α－亞麻酸被夾帶損失所致。綜合考慮，脂肪酸/尿素為0.3是較為合適的，此時(shí)，α－亞麻酸回收率為 72.5%，純度83.56%，明顯優(yōu)于Ahmed等［6］采用尿素包合分離Mucor zychae脂質(zhì)γ－亞麻酸的效果(γ－亞麻酸純度為63.5%，回收率為68%)。此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿素包合富集α－亞麻酸時(shí)，亞油酸脫除難度最大。

圖2 脂肪酸/尿素對α－亞麻酸回收率的影響

2.2 尿素濃度對包合效果的影響

理論上講，脂肪酸/尿素等條件不變，僅改變尿素濃度并不會影響包合的選擇性。但尿素濃度增加，提高了脂肪酸與尿素分子的碰撞幾率，因此包合更容易實(shí)現(xiàn)。

圖3 尿素濃度對包合效果的影響

由圖3可以看出，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低(20%、25%)盡管α－亞麻酸總回收率較高，但富集產(chǎn)物中α－亞麻酸含量較低。這應(yīng)歸因于尿素、脂肪酸濃度低，分子碰撞幾率下降，因此包合效率下降。另一方面冷卻時(shí)產(chǎn)生的尿素晶體減少，包合脫除飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸的能力下降。但尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從30%提高至60%，尿素的包合選擇性沒有顯著變化，所富集的α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，但脂肪酸/尿素是固定的，因此單位溶劑的脂肪酸載荷量顯著增加，這對于工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性是十分有利的。結(jié)合考慮α－亞麻酸回收率，試驗(yàn)確定尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%較為合適。

2.3 包合溫度和時(shí)間對包合效果的影響

溫度會影響尿素和脂肪酸的溶解度及結(jié)晶速度，因此會對包合效果產(chǎn)生重要影響。既定條件下(脂肪酸/尿素為0.3，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，包合時(shí)間為12 h)，不同溫度對包合效果的影響如圖4所示。

圖4 溫度對包合效果的影響

數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果表明:－30～10℃范圍內(nèi)α－亞麻酸純度及回收率均沒有明顯差別。但－40℃條件下亞麻酸的純度顯著降低(僅為40%左右)，含量差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。這可能是由于－40℃低于乙醇中的α－亞麻酸的凝固點(diǎn)，因此脂肪酸和尿素同步凝固析出，使得包合的選擇性急劇降低。時(shí)間對包合效果的影響趨勢與溫度相似，脂肪酸/尿素為0.3，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，10℃下分別包合1、2、4、8、12、24 h，α－亞麻酸的純度及回收率均沒有顯著性差異。因此綜合考慮包合效果和經(jīng)濟(jì)性，試驗(yàn)確定包合溫度為0℃，時(shí)間為2 h。

2.4 二次包合的效果

為進(jìn)一步提高產(chǎn)物中α－亞麻酸的純度，試驗(yàn)對包合富集的產(chǎn)物進(jìn)行了二次包合。包合條件選擇單因素獲得的較優(yōu)條件:尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，脂肪酸/尿素為0.3，包合溫度為0℃，時(shí)間為2 h，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)顯示相對于一次包合，二次包合效果并不明顯，α－亞麻酸的純度略有增加(一次包合為83.56%，二次包合為84.92%)，但亞油酸、油酸、硬脂酸、棕櫚酸脫除效果不佳。而二次包合的α－亞麻酸總回收率則從72%降至65%，由此可見采用二次脲包法提高α－亞麻酸的純度效果并不理想。而Ahmed等［6］的結(jié)果顯示，通過二次包合可將γ－亞麻酸的純度由67%提高到99%。但二次包合脂肪酸回收率并未給出，估計(jì)其較高的亞麻酸純度的獲得是以大幅度犧牲亞麻酸回收率為代價(jià)實(shí)現(xiàn)的。

表1 包合前后脂肪酸的組成及含量

2.5 銀離子色譜分離α－亞麻酸

由于二次包合不能有效脫除殘余的亞油酸、油酸和微量棕櫚酸、硬脂酸，本研究嘗試銀離子色譜對一次包合富集的產(chǎn)物進(jìn)一步純化。較優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果列于表2中。

表2 銀離子柱色譜各餾分的α－亞麻酸含量及回收率

數(shù)據(jù)顯示不被銀離子吸附的棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸及少量穿透的不飽和脂肪酸主要存在于石油醚相中，油酸和亞油酸主要被石油醚/丙酮(99∶1)洗脫。而吸附較強(qiáng)的α－亞麻酸被強(qiáng)極性的丙酮?jiǎng)冸x，其產(chǎn)物中α－亞麻酸純度接近100%，回收率86.2%，充分顯示出銀離子絡(luò)合分離的高選擇性。

3 結(jié)論

尿素包合分離蠶蛹α－亞麻酸工藝條件中，脂肪酸尿素質(zhì)量比對包合效果影響最大，脂肪酸/尿素一定條件下，尿素濃度提高對包合選擇性影響不大，但單位體積溶劑的載荷增加。－30～10℃包合2～4 h，對包合效果影響不顯著。試驗(yàn)中二次尿素包合不能有效脫除低含量的亞油酸、油酸。相比之下，銀離子硅膠色譜選擇性更高，可使亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從80%提高到近100%。

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Isolation of α－Linolenic Acid from Bombyx mori L.Silkworm Chrysalis

Lu Zhonghui1Pan Qiuyue2Meng Xianghe1Sun Peilong1
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology1，Hangzhou 310014)
(Department of Application＆Engineering，Zhejiang Economic＆Trade Polytechnical2，Hangzhou 310018)

To obtain high purity alpha linolenic acid(ALA)from silkworm lipids，urea crystallization and argentated silica gel chromatography were employed in this work.Results suggested that fatty acid/urea ratio was the key factor for ALA purity and recovery，and urea concentration，crystallization temperature，and time are in the next place.When crystallization was carried at 0℃ for 2 h，with fatty acids/urea ratio of 0.3 and urea concentration of 32.53%，ALA percentage increased from 32.52%to 83.56%，and when the enriched lipid sample was subjected to urea crystallization for the second time，the concentration of ALA did not further increased，and the ALA recovery decreased significantly.However，when the enriched lipid was subjected instead to argentated silica gel chromatography (ASGC)，the ALA percentage increased to 100%，and ALA recovery was 86.2%.It is indicated that the isolation of high purity ALA from silkworm lipids by urea crystallization and then by ASGC is feasible.

α－linolenic acid，silkworm，purification，urea inclusion，argentated silica gel chromatography

TQ645.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1003－0174(2010)11－0074－04

浙江省科技廳項(xiàng)目(2007C32024)

2009－10－27

魯仲輝，男，1982年出生，碩士，食品科學(xué)

孫培龍，男，1964年出生，博士生導(dǎo)師，多糖、脂類