離子交換色譜-積分脈沖安培法測定大蒜中的蒜氨酸*

李存芝，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

離子交換色譜-積分脈沖安培法測定大蒜中的蒜氨酸*

李存芝，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

為測定新鮮大蒜中蒜氨酸，采用離子交換色譜-積分脈沖安培(IEC-IPA)分析法，以離子交換分離柱分離，積分脈沖安培電化學(xué)檢測，柱溫:30℃;流動(dòng)相:離子水、250 mmol/L NaOH及1mol/L醋酸鈉進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.25mL/min。測得結(jié)果:蒜氨酸保留時(shí)間為5.100～5.200 min，濃度在0.45～3.0μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)0.997 9，檢測限0.05μg/mL，加樣回收率為96.7%，標(biāo)準(zhǔn)差1.7%;測得的廣東蒜及山東蒜的蒜氨酸含量分別是1.262 9%、1.511 4%。

大蒜(Allium sativum L.)，蒜氨酸，離子色譜法，積分脈沖安培檢測

大蒜(Allium sativum L.)是百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)［1］。據(jù)報(bào)道新鮮大蒜中含有大量大蒜素的前體物質(zhì)——蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜)［2］。研究亦表明，蒜氨酸是大蒜中的主要活性成分，具有抗氧化、清除自由基、降脂、抗腫瘤、抗血栓等多項(xiàng)功能［3］。所以測定蒜氨酸的含量已成為評(píng)定大蒜及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)。

由于大蒜成分的多樣性和不穩(wěn)定性，直接測定蒜氨酸含量存在一定困難，且各種分析結(jié)果有很大差異，至今尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法測定大蒜中蒜氨酸含量。傳統(tǒng)的定硫法精確度極低;薄層掃描法［4］、高效液相色譜法［5～8］、液質(zhì)聯(lián)用法［9］、高效毛細(xì)管電泳法［10］、4-MP［11］測定法、高效離子對(duì)色譜法［12］、柱前或柱后衍生化后測定［13］等方法前處理復(fù)雜，檢測周期長，或需特殊的儀器，在應(yīng)用中受到限制。

離子交換色譜(IEC)法對(duì)于分離氨基酸類物質(zhì)具有柱效高、分離效果好的特點(diǎn)，積分脈沖安培檢測器(IPA)是一種氧化還原檢測器，對(duì)于含有硫原子的蒜氨酸應(yīng)當(dāng)具有較好的響應(yīng)。因此，本文探討離子交換色譜-積分脈沖安培(IEC-IPA)法用于測定蒜氨酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

新鮮廣東大蒜和山東大蒜，購于廣東石牌蔬菜市場。

250 mmol/L NaOH 溶液(Fisher公司，美國)，1mol/L醋酸鈉(戴安公司，批號(hào)050205)，超純水(蒸餾水再經(jīng)過Millipore超純水系統(tǒng)制備)，合成蒜氨酸［13］(自制)，無水乙醇，雙蒸水。

1.2 樣品配制

1.2.1 合成蒜氨酸溶液的配制

精密稱取22.5 mg蒜氨酸，用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇定容至25mL，使之成為900μg/mL的蒜氨酸母液，以此溶液作倍比稀釋及3∶2倍稀釋，配制成600、450、300、225、112.5μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，再用超純水將上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋到3、2.25、1.125、0.9、0.6、0.45μg/mL，用 0.2 μm 濾膜過濾進(jìn)樣。在離子交換色譜條件下分析蒜氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制溶液的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 不同大蒜樣品液的制備

稱取購自農(nóng)貿(mào)市場的新鮮、去皮的廣東金山火蒜或山東金鄉(xiāng)大蒜各30.00 g，加入50mL的水，微波煮沸5 min，研缽研碎，無損失地轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中定容，搖勻后離心過濾(4 000 r/min，20 min)，取上清液用超純水稀釋至100倍，用0.2 μm一次性濾頭過濾后，吸取0.25μL進(jìn)樣，測定樣品中的蒜氨酸。

1.3 IEC-IPA測定條件

ICS-2500型離子色譜儀(戴安公司，美國)，主要配置:含在線脫氣裝置的四元梯度泵GP50、柱溫箱LC30、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器EG50、脈沖安培電化學(xué)檢測器ED50(Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極)、離子交換色譜柱(即氨基酸分離柱，Amino PACPA10，2 mm ×250 mm)，氨基酸保護(hù)柱(Amino PAC PA10，2 mm ×50 mm)，柱溫:30℃，流速:0.25mL/min，進(jìn)樣量:0.25μL，流動(dòng)相 A:去離子水，流動(dòng)相B:250 mmol/L氫氧化鈉溶液，流動(dòng)相C:1mol/L醋酸鈉，用上述3種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，詳細(xì)梯度淋洗程序見下表1，結(jié)果分析采用Chromeleon 6.0工作站。

表1 離子色譜梯度淋洗程序(體積分?jǐn)?shù))

2 結(jié)果與分析

2.1 17種常見標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的離子色譜圖

圖1是利用IEC-IPA法分析的17種常見標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的離子色譜圖，由圖1可見IEC-IPA法對(duì)17種常見氨基酸的分離效果較好。

圖1 17種常見標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的離子色譜圖

2.2 合成蒜氨酸的離子色譜圖

圖2是合成蒜氨酸的離子色譜圖，其保留時(shí)間為5.200 min，其含有少量的精氨酸(1.175 min)雜質(zhì)。比較圖1與圖2的色譜峰可以看出，在本實(shí)驗(yàn)條件下，蒜氨酸(5.200 min)不會(huì)與相鄰的賴氨酸(3.517 min)、丙氨酸(6.15 min)色譜峰重合，即蒜氨酸與其他氨基酸混在一起時(shí)，仍可以取得較好的分離效果。

圖2 合成蒜氨酸的離子色譜圖

2.3 線性關(guān)系的考察

測定上述1.2.1項(xiàng)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量均為5μL。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出合成蒜氨酸的工作曲線為Y=36.397 X+1.903 7，相關(guān)系數(shù)r=0.997 9，表明蒜氨酸在質(zhì)量濃度在0.45～3.0μg/mL時(shí)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 檢測限和精密度

分別精確量取上述1.2.1項(xiàng)中配制的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.45μg/mL)1mL，置于5mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣量5μL。以信噪比S/N=5計(jì)，蒜氨酸的檢測限為0.05μg/mL。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測得峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%。該檢測限較用紫外檢測等方法要低得多［14］，這是因?yàn)榉e分脈沖安培檢測器是一種氧化還原型檢測器，蒜氨酸具有較好的氧化還原性，因而對(duì)該類檢測器具有較好的響應(yīng)，所以，檢測限較低。

2.5 蒜氨酸回收率的測定

在供試品溶液中加入已知量的合成蒜氨酸，進(jìn)行回收率測定，測定結(jié)果(表2)表明其回收率一般為95.5%～98.8%，可見，其回收率較高。

2.6 廣東蒜及山東蒜中蒜氨酸含量測定

圖3和圖4分別是廣東蒜及山東蒜的蒜氨酸色譜圖，其酸氨酸的保留時(shí)間分別是5.200和5.185 min，與圖2中合成標(biāo)準(zhǔn)蒜氨酸的保留時(shí)間(5.200 min)基本一致，其微小差異應(yīng)為進(jìn)樣誤差所致。

所測廣東蒜及山東蒜樣品的蒜氨酸含量見表3。

表3表明，不同產(chǎn)地的大蒜中蒜氨酸含量差異較大;山東大蒜的酸氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于廣東蒜，這可能與廣東蒜生長季節(jié)短、含水量相對(duì)較高有關(guān)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 廣東蒜及山東蒜樣品的蒜氨酸含量

圖3 廣東蒜的蒜氨酸色譜圖

圖4 山東蒜的蒜氨酸色譜圖

3 結(jié)論

利用IEC-IPA法測定大蒜樣品中的酸氨酸，線性范圍為0.45～3.0μg/mL，檢測限低至 0.05μg/mL，可以同時(shí)測定其他氨基酸。該法簡便、快速、準(zhǔn)確、分離效果好。

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Ion-exchange Chromatography-integrated Pulsed Amperometric for Determination of Alliin

Li Cun-zhi，Huang Xue-song
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To develop ion-exchange chromatography-integrated pulsed amperometric(IEC-IPA)method for the determination of alliin in fresh garlic.The IEC-IPA conditions were:ion-exchange separation column，an integrated electrochemical pulsed amperometric detector，column temperature:30℃，mobile phase:deionized water、250 mmol/L NaOH and 1mol/L NaAC，flow rate was at:0.25mL/min.The result showed that good relationship was linear in the range of 0.45～3.0μg/mL(r=0.997 9)alliin concentration.The limits of detection were 0.05μg/mL.The recovery was 96.7%and relative standard deviations was less than 1.7%.The retention time of alliin is 5.100～5.200 min.And the alliin content of Guangdong and Shandong Garlic are 1.262 9%、1.511 4%respectively.We concluded that IEC-IPA method has good separation efficiency for detection of alliin.This method is sensitive，simple，rapid and the results are good，accurate and reliable.IEC-IPA is suitable for determining the alliin in garlic and its products.

garlic(Allium sativum L.)，alliin，ion chromatography，integrated pulsed amperometric detector

博士，講師。

*國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(2007AA10Z300)和國家自然科學(xué)基金(30671472)資助

2010－02－15，改回日期:2010－10－11