酶解大蒜渣制備果葡糖漿*

黃菁，張寧，張永韜，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

酶解大蒜渣制備果葡糖漿*

黃菁，張寧，張永韜，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

采用2種商品蔗糖酶水解大蒜渣制備果葡糖漿，經(jīng)過單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)確定了Sigma公司的蔗糖酶水解率較高。其最適酶解條件:pH值為4.8，溫度為45℃，底物濃度為8mg/mL，加酶量為210 U/mL，酶解時間為12 h。在此酶解條件下，蔗糖酶的水解率達(dá)到80%，經(jīng)離子色譜-積分脈沖安培檢測法分析，酶解產(chǎn)物以果糖和葡萄糖為主。

蔗糖酶，大蒜渣，果葡糖漿

果葡糖漿是以果糖與葡萄糖為主要組分的健康型糖源，其中果糖含量較高。果葡糖漿的生產(chǎn)主要是以玉米淀粉通過淀粉酶，葡萄糖糖異構(gòu)酶兩步法生產(chǎn)［16］，該方法純化工藝復(fù)雜，果糖含量不高。果聚糖在無機(jī)酸或酶的作用下可水解成為果葡糖漿，因此通過水解一些含果聚糖的天然原料如菊粉制備果葡糖漿成為了一條新的途徑。其中，通過酸法水解天然果聚糖原料制備果葡糖漿，果糖不穩(wěn)定、風(fēng)味差、色澤深，已逐漸被淘汰。而酶法水解則條件溫和，產(chǎn)量高，副產(chǎn)物少，逐漸成為研究的熱點(diǎn)［16］。

大蒜(Allium sativum)營養(yǎng)豐富，其中75%以上的干物質(zhì)由碳水化合物組成，主要是大蒜果聚糖［1］。其果聚糖的果糖與葡萄糖比例約為15∶1，是制備果葡糖漿的理想原料。本文采用商品蔗糖酶制劑降解大蒜渣制備果葡糖漿，擬為生產(chǎn)質(zhì)高，價廉的果葡糖漿開發(fā)新原料。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

市售大蒜;蔗糖酶，Sigma和裕立寶生物公司;Na2HPO4、檸檬酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、濃 H2SO4、苯酚、Na2SO3(均為分析純)，天津市福晨化工廠;3，5-二硝基水楊酸，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠;葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖，均為Sigma色譜純;蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，均為WAKO(日本)色譜純。

HH－4恒溫水浴鍋、SHA－B水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市宏華儀器廠;KDC－1044低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;721分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHG－9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DIONEX－2500離子色譜儀，配有GP50四元梯度泵，AS50自動進(jìn)樣器，美國戴安。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜渣預(yù)處理

將市售大蒜搗碎，用蒸餾水提取大蒜渣中的多糖，固液比 =1∶2，95℃下煮沸 40 min［3］，再保溫 1 h，紗布過濾，經(jīng)3 500 r/min離心20 min，上清液即為大蒜果聚糖液［3］。分別測定其中總糖和還原糖的含量。

1.2.2 蔗糖酶水解大蒜多糖

2種蔗糖酶分別用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，加入至大蒜果聚糖液中，調(diào)至pH為5.0，溫度保持在50℃，酶解12 h，得出樣品，分別測其總糖含量和還原糖含量，計算酶解得率。2種蔗糖酶均用酶活濃度、底物濃度、溫度、pH值以及時間為單因素試驗(yàn)，再對較高提取率的酶選出4種差異因素做4因素3水平的正交試驗(yàn)，測定最終蔗糖酶的水解率。

1.2.3 蔗糖酶酶活的測定

用pH值為4.6的乙酸鈉-醋酸緩沖液對2種蔗糖酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，?mL酶液加入4mL蔗糖液(濃度為0.05mol/L)，40℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入1mL 1mol/L的NaOH搖勻，終止酶促反應(yīng)［2］。測定反應(yīng)液中的還原糖含量，計算酶活。得出初始Sigma蔗糖酶的酶活為1 320 U/mL，裕立寶蔗糖酶的酶活為1 500 U/mL。

1.2.4 水解液中總糖的測定

苯酚-硫酸法［4］。

1.2.5 水解液中還原糖的測定

3，5-二硝基水楊酸法［5］。

1.2.6 色譜條件

1.2.6.1 單糖檢測的色譜條件

分析柱:CarboPac PA－10(4 mm ×250 mm)，保護(hù)柱:CarboPac PA－10G(4 mm×50 mm);流動相:3%250 mmol NaOH;體積流量:0.20mL/min;進(jìn)樣體積:25μL;柱溫:30℃;檢測器:ED50A安培檢測器(金工作電極，Ag-AgCl參比電極，鈦對電極)。單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖如圖1。

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖

1.2.6.2 低聚果糖檢測的色譜條件

分析柱:CarboPac PA－100(4 mm×250 mm)，保護(hù)柱:CarboPac PA-100G(4 mm×50 mm);體積流量:0.20mL/min;進(jìn)樣體積:25μL;柱溫:30℃;檢測器:ED50A安培檢測器(金工作電極，Ag-AgCl參比電極，鈦對電極)。流動相的比例如表1，低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖如圖2。

圖2 低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖(混合液由1mg/mL的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖以1∶1∶1的體積比混合而成)

表1 流動相的比例設(shè)置

1.2.7 蔗糖酶水解率的計算

式中:m1為水解后還原糖的含量(mg);m0為水解前還原糖的含量(mg);m為樣品液中總糖的含量(mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖酶水解條件

2.1.1 溫度對蔗糖酶水解率的影響

分別在 35、40、45、50、55、60℃下，pH 值為 5.0，酶解12 h，水解率如圖3所示。

圖3 溫度對水解率的影響

由圖3可以看出，當(dāng)溫度由35℃升至45℃時，2種蔗糖酶的水解率都升高，50℃時，蔗糖酶的水解率達(dá)到最高，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，反應(yīng)速率加快［15］。但由50℃升至60℃時，水解率驟降，這可能是由于溫度過高，導(dǎo)致蔗糖酶本身的熱穩(wěn)定性下降［6］，從而使得蔗糖酶的活性發(fā)生變化，導(dǎo)致水解率降低。因此，實(shí)驗(yàn)用2種酶的最適溫度都在45～50℃。

2.1.2 pH值對蔗糖酶水解率的影響

分別研究 pH 值 3.0、4.0、4.4、5.0、6.0、7.0 下，溫度為50℃，水解12 h的水解結(jié)果(如圖4)。

由圖4可知，當(dāng)pH值由3升至5時，隨著pH值的增加，2種蔗糖酶的水解率小幅度的升高，但當(dāng)pH值由5升至6時，Sigma蔗糖酶的水解率稍微降低，但裕立寶蔗糖酶水解率繼續(xù)升高，這是因?yàn)槊傅幕钚灾行膶H值敏感［6］，不同酶具有不同的最適pH值。當(dāng)pH值由6升至7時，添加Sigma蔗糖酶的樣品水解率驟降，添加裕立寶蔗糖酶的樣品水解率也明顯下降。因此，sigma蔗糖酶和裕立寶蔗糖酶最適pH值范圍均為4.0～6.0。

圖4 pH對水解率的影響

2.1.3 加酶量對蔗糖酶水解率的影響

Sigma 蔗糖酶分別以 35、70、140、175、210 U/mL五種酶量，裕立寶蔗糖酶分別以 1.6、8、40、50、80U/mL加酶量，加入到底物濃度為12mg/mL的大蒜果聚糖液中，pH值為5.0、50℃下水解12 h，結(jié)果如圖5和圖6。

圖5 Sigma蔗糖酶的加酶量對水解率的影響

圖6 裕立寶蔗糖酶的加酶量對水解率的影響

由圖5和圖6可以看出，在反應(yīng)初期，隨著加酶量的增加，2種蔗糖酶的水解率逐漸增加，這是因?yàn)殡S著酶活量的增加，水解體系中的反應(yīng)速率增加，提高了水解率。當(dāng)Sigma蔗糖酶加酶量達(dá)到175 U/mL后，蔗糖酶的水解率增加不顯著，基本呈水平線。裕立寶蔗糖酶加酶量達(dá)到40 U/mL時，蔗糖酶的水解率較大，再增加加酶量時，水解率趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)楹笃谒馑俾蕼p慢，水解率逐漸達(dá)到最大，因而趨于穩(wěn)定［10］。因此，從水解率和經(jīng)濟(jì)方面考慮，分別選擇175 U/mL、40U/mL的加酶量比較適合。

2.1.4 底物濃度對蔗糖酶水解率的影響

研究不同底物濃度 2、4、8、10、12mg/mL 的大蒜果聚糖液中，pH值為5.0時、50℃下水解12h，得結(jié)果如圖7所示。

圖7 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖7可知，當(dāng)?shù)孜餄舛扔?mg/mL升至8mg/mL時，隨著底物濃度的增加，Sigma蔗糖酶的水解率呈上升趨勢，這表明底物濃度對Sigma蔗糖酶水解率的影響十分明顯［10］;當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到8mg/mL時，增加底物濃度，蔗糖酶水解率增加緩慢甚至不再增加。而裕立寶蔗糖酶的水解率也呈上升趨勢，但變化不顯著，這表明底物濃度對裕立寶蔗糖酶水解率的影響不顯著［14］。一般當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到10mg/mL時，酶解率達(dá)到最高，若果聚糖濃度太高，對蔗糖酶的水解率有一定的抑制作用，甚至向蔗糖酶轉(zhuǎn)移方向發(fā)展［10］。

2.1.5 時間對蔗糖酶水解率的影響

底物濃度為12mg/mL，50℃、pH值為5.0時研究不同水解時間 2、4、6、12、18、24 h 的水解率，結(jié)果如圖8所示。

圖8 時間對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖8可知，對于Sigma蔗糖酶，2～18 h時，隨著時間的增加，蔗糖酶的水解率呈上升趨勢，18～24 h時，單位時間內(nèi)水解率沒有顯著提高。對于裕立寶蔗糖酶，2～12 h時，水解率顯著提高，12～24 h時，蔗糖酶水解率不再增加。隨著時間的延長，并不能顯著提高酶解率，原因可能是高濃度的果糖對蔗糖酶具有抑制作用［14］。因此從經(jīng)濟(jì)和能耗的角度考慮，酶解時間選擇12 h。

2.2 酶解條件的優(yōu)化

在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，可以看出Sigma蔗糖酶的水解率較高。選擇溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)、底物濃度(D)作為考察因素，每個因素選擇3個水平做正交試驗(yàn)，因素水平見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 Sigma蔗糖酶水解因素水平表

由表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)號為5的正交試驗(yàn)得出的水解率最高。按極差大小決定的因素主次順序?yàn)闇囟龋緋H＞底物濃度＞加酶量。水解溫度和pH值為主要影響因素。結(jié)合極差與方差分析，得出最佳水解率的條件是:A2B3C2D1。即溫度為45℃，pH為4.8，加酶量為210 U/mL，底物濃度為8mg/mL，水解率達(dá)到80%。

表3 sigma蔗糖酶正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 酶解產(chǎn)物的成分分析

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，Sigma蔗糖酶的水解率達(dá)到80%。取最終樣品根據(jù)色譜條件進(jìn)行樣品檢測。樣品中單糖結(jié)果如圖9，樣品中低聚糖結(jié)果如圖10所示。

圖9 樣品中單糖的色譜圖

圖10 樣品中低聚糖的色譜圖

由圖10可以看出，樣品中果聚糖含量較少，酶解比較徹底，產(chǎn)物主要由大量的單糖組成;由圖9可以看出，樣品中單糖是由大量的果糖和少許的葡萄糖組成，其中以果糖為主，而鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及木糖含量很少;通過含量的計算，得出其中果糖含量約占樣品成分的85%，葡萄糖含量約占9%，低聚糖及少量木糖等約占6%，因此樣品中的成分以果糖為主，葡萄糖為輔;得出的含量結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致，因此最終樣品為果葡糖漿。

3 結(jié)論

采用2種蔗糖酶對大蒜渣進(jìn)行水解，Sigma粉狀蔗糖酶的水解率略高于裕立寶的液態(tài)蔗糖酶。結(jié)果顯示，最適酶解條件是:pH值為4.8，溫度為45℃，加酶量為210 U/mL，底物濃度為8mg/mL，最終水解率可以達(dá)到80%。經(jīng)離子色譜-積分脈沖安培檢測法的鑒定，酶解產(chǎn)物為果葡糖漿，組成成分以果糖為主，葡萄糖為輔。

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High Fructose Syrup Production by Invertase Hydrolysis on Garlic Dregs

Huang Jing，Zhang Ning，Zhang Yong-tao，Huang Xue-song
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Two sucrases were used for high fructose syrup production by hydrolyzing garlic dreg at optimal condition obtained from single－factor and orthogonal experiments.It was found that the high fructose syrup yield of 80%was achieved at pH 4.8，45 ℃，substrate concentration 8mg/mL，and enzyme concentration of 210 U/mL substrate after hydrolyzing for 12h.The hydrolysis products mainly consisted of fructose and glucose determined by ion chromatography－integrated pulsed aperometric detection.

invertase，garlic dregs，high fructose syrup

碩士研究生(張寧副教授為通訊作者)。

*國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(2007AA10Z300)

2010－07－06，改回日期:2010－09－15