稀釋率對(duì)短乳桿菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)

稀釋率對(duì)短乳桿菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)

建立了短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法。在32℃、pH 5.0、150 r/min 條件下，通過(guò)考察不同稀釋率(0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1和 0.14 h－1)時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)體系中菌體濃度、葡萄糖利用和GABA產(chǎn)量3項(xiàng)指標(biāo)的變化，研究了稀釋率對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)稀釋率為0.06 h－1和 0.14 h－1時(shí)，培養(yǎng)不能達(dá)到穩(wěn)態(tài);當(dāng)稀釋率為 0.08 h－1、0.01 h－1及 0.12 h－1時(shí)，反應(yīng)體系均能進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。在考察的幾個(gè)稀釋率中，0.10 h－1最好。

短乳桿菌NCL912，連續(xù)培養(yǎng)，稀釋率，γ－氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然存在的非蛋白氨基酸，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)［1］。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功能［2－7］。

GABA的制備有化學(xué)合成法和微生物合成法。相比而言，化學(xué)合成法成本高、安全性差;而微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA是一種安全、高效、低成本的方法。細(xì)菌、酵母以及真菌［8～11］均能發(fā)酵生產(chǎn)GABA。其中乳酸菌生產(chǎn)的GABA及其菌體均能直接應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，這就大大增加了其研究開(kāi)發(fā)的意義。利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［12－17］。但所采用的均是分批發(fā)酵技術(shù)，目前尚未見(jiàn)有關(guān)乳酸菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)GABA的報(bào)道。微生物的連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)是相對(duì)于分批培養(yǎng)而言的。與分批發(fā)酵相比，連續(xù)培養(yǎng)有其特有的優(yōu)點(diǎn)，如不需要分批發(fā)酵的間隔準(zhǔn)備工作，可連續(xù)生產(chǎn)，微生物能夠維持一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡等。因而在動(dòng)植物細(xì)胞和微生物的培養(yǎng)，微生物的生理生化研究，細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等方面有著廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，篩選出1株高產(chǎn)GABA的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912［18］，并對(duì)其分批發(fā)酵合成GABA的工藝進(jìn)行了研究，確定了分批培養(yǎng)的發(fā)酵條件［19］。進(jìn)一步對(duì)短乳桿菌 NCL912連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)GABA進(jìn)行了初步的研究，成功組建了連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng);研究了不同稀釋率(dilution rate，D)對(duì)乳酸菌連續(xù)培養(yǎng)體系的影響，探討了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)在GABA生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司;pH電極，蘇州市漢星電化學(xué)有限公司;pH控制儀，日本東京B.E.Marubishi有限公司;79－1型磁力攪拌器，上海儀表(集團(tuán))供銷公司;蠕動(dòng)泵，蘭格恒流泵有限公司;溫度控制系統(tǒng)為自己組裝，水缸、可控溫加熱棒等購(gòu)自市場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種:短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912，高產(chǎn)GABA，由本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中分離并保存［18］。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖，25g/L;酵母浸粉，6.25g/L;大豆蛋白胨，6.25g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.15mol/L;吐溫80，2mL/L，用2mol/L H2SO4調(diào)pH值為5.0，高壓滅菌。

連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:葡萄糖，30g/L;酵母浸粉，12.5g/L;大豆蛋白胨，12.5g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.5mol/L;吐溫 80，2mL/L。培養(yǎng)基的氮源，MSG，以及其他成分分別高壓滅菌，121℃，20min，然后混合備用。

1.3 種子活化方法

取保藏菌種接種于5mL種子培養(yǎng)基中，32℃靜置培養(yǎng)24 h。按此方法活化2次后，以5%的接種量轉(zhuǎn)接于100mL種子培養(yǎng)基，32℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，即為種子培養(yǎng)物。

1.4 連續(xù)培養(yǎng)裝置圖與操作方法

連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。

圖1 連續(xù)培養(yǎng)裝置簡(jiǎn)圖

反應(yīng)器為800mL玻璃罐，工作體積設(shè)定為400mL。組裝系統(tǒng)并配制培養(yǎng)基，滅菌后，打開(kāi)蠕動(dòng)泵往反應(yīng)器內(nèi)流加360mL已混合的發(fā)酵培養(yǎng)基，用注射器接種40mL種子培養(yǎng)物，pH用pH控制儀自動(dòng)控制。經(jīng)過(guò)10 h培養(yǎng)，打開(kāi)蠕動(dòng)泵以一定稀釋率向反應(yīng)器內(nèi)流加培養(yǎng)基，開(kāi)始連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)溫度32℃;攪拌速度150 r/min;pH 5.0，用2mol/L H2SO4溶液自動(dòng)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)選取5種不同的稀釋率，分別為 0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1及0.14 h－1。每12 h取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中的菌體濃度、GABA濃度及殘?zhí)菨舛取?/p>

1.5 培養(yǎng)液樣品相關(guān)參數(shù)檢測(cè)

菌體濃度:樣品稀釋5倍后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值(A600)。GABA濃度:采用預(yù)染紙色譜法測(cè)定［20］。殘?zhí)菨舛?采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)測(cè)定。

1.6 連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)的確定

連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行60 h后，連續(xù)3次取樣分析，如測(cè)定的3種參數(shù)指標(biāo)的波動(dòng)范圍在5%以內(nèi)，可認(rèn)為連續(xù)培養(yǎng)已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)主要依據(jù)菌體濃度、GABA濃度及葡萄糖濃度的檢測(cè)結(jié)果，確定連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是否達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用軟件Sigma Plot 10.0分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 稀釋率對(duì)乳酸菌連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)建立的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了在不同稀釋率情況下，乳酸菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)運(yùn)行狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2～圖6所示。由圖2可知，為當(dāng)稀釋率為0.06 h－1時(shí)，在前36 h反應(yīng)體系中葡萄糖含量急劇下降，導(dǎo)致隨后培養(yǎng)過(guò)程中菌體濃度下降，且GABA濃度不能保持穩(wěn)定。說(shuō)明當(dāng)D=0.06 h－1時(shí)，培養(yǎng)基補(bǔ)給速度小于消耗速度，營(yíng)養(yǎng)不足以維持菌體的生長(zhǎng)，致使菌體大量死亡，培養(yǎng)不能進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。圖3、圖4及圖5表明，當(dāng)稀釋率為分別 0.08 h－1、0.10 h－1和 0.12 h－1時(shí)，在培養(yǎng)進(jìn)行到60 h后，反應(yīng)體系中菌體、GABA濃度及葡萄糖濃度均能在一定水平維持穩(wěn)定，整個(gè)系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。由圖6可知，當(dāng)稀釋率為0.14 h－1時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的菌體濃度逐步下降，GABA濃度及葡萄糖濃度有比較大的波動(dòng)。說(shuō)明當(dāng)D=0.14 h－1時(shí)，發(fā)酵液稀釋速率大于菌體增殖速率，菌體不斷被洗出，0.14 h－1已接近臨界稀釋率DC(相當(dāng)于最大比生長(zhǎng)速率μmax時(shí)的D值)。

圖2 稀釋率0.06 h－1時(shí)菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖3 稀釋率0.08 h－1時(shí)菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖4 稀釋率0.10 h－1時(shí)菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖5 稀釋率0.12 h－1時(shí)菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖6 稀釋率0.14 h－1時(shí)菌體、GABA和葡萄糖的變化

2.2 稀釋率對(duì)GABA濃度、葡萄糖濃度及GABA產(chǎn)率的影響

當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，不同稀釋率情況下連續(xù)培養(yǎng)體系中GABA濃度、葡萄糖濃度及GABA產(chǎn)率如表1所示。

由圖7(A)可知，隨著稀釋率的增大，GABA濃度逐漸降低。GABA濃度在D=0.01 h－1時(shí)比D=0.08 h－1時(shí)低 9.97%，在 D=0.12 h－1時(shí)比 D=0.10 h－1時(shí)低14.65%。由圖7(B)可知，當(dāng)稀釋率分別為0.08 h－1和0.10 h－1時(shí)，反應(yīng)體系中殘余葡萄糖濃度均比較低，分別為0.756 5±0.102 3g/L、1.039 7±0.071 3g/L;當(dāng)稀釋率為0.12 h－1時(shí)，殘?zhí)菨舛却蠓黾訛?6.283 1±0.414 5g/L。說(shuō)明低稀釋率(0.08、0.10 h－1)利于菌體對(duì)葡萄糖的充分利用，而高稀釋率(0.12 h－1)則會(huì)造成大量浪費(fèi)。由圖7(C)可知，GABA產(chǎn)率隨稀釋率的增大而增加，在D=0.10 h－1時(shí)比 D=0.08 h－1時(shí)高12.53%，D=0.12 h－1時(shí)比 D=0.10 h－1時(shí)高2.41%，GABA產(chǎn)率的增加幅度隨稀釋率的增大而減小，說(shuō)明高稀釋率(D=0.12 h－1)不利于菌體充分發(fā)酵生產(chǎn)GABA。綜合GABA產(chǎn)率和葡萄糖剩余2個(gè)因素，短乳桿菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)GABA選取0.10 h－1的稀釋率較為合適。

表1 短乳桿菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果

圖7 稀釋率對(duì)GABA濃度(A)、葡萄糖濃度(B)及GABA產(chǎn)率(C)的影響

3 結(jié)論

本研究成功建立了短乳桿菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)GABA的方法，并以連續(xù)培養(yǎng)中菌體濃度、葡萄糖利用和GABA產(chǎn)量為指標(biāo)，考察了不同稀釋率對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的影響。當(dāng)稀釋率為0.06 h－1和0.12 h－1時(shí)，培養(yǎng)不能達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而當(dāng)稀釋率為 0.08 h－1、0.01 h－1及0.12 h－1時(shí)，反應(yīng)體系均能進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。隨著稀釋率的增大，穩(wěn)態(tài)時(shí)GABA的產(chǎn)量下降，而產(chǎn)率升高。稀釋率為0.08 h－1和0.10 h－1時(shí)，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛缺容^低，菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用比較充分;當(dāng)稀釋率增大為0.12 h－1時(shí)，發(fā)酵液中則有(16.283 1±0.414 5)g/L葡萄糖殘余。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)短乳桿菌NCL912進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)GABA的高效連續(xù)生產(chǎn)。

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Effect of Dilution Rate on γ-Aminobutyric Acid Production by Continuous Culture of Lactobacillus brevis NCL912

Qiu Ting，Li Hai-xing，Cao Yu-sheng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-Geman Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

A continuous culture method of Lactobacillus brevis NCL912 was developed for production of γ－aminobutyric acid.The effects of the dilution rate on the biomass，residual glucose and GABA yielding of the continuous culture were investigated.The results indicated that dilution rate had a significant effect on the cell proliferation and GABA production.Steady state could not be obtained when dilution rates were 0.06 h－1or 0.14 h－1.When dilution rates were 0.08 h－1，0.10 h－1or 0.12 h－1，the culture system could reach the steady states.Among the dilution rates tested，0.10 h－1was the best one for the GABA continuous production.

Lactobacillus brevis NCL912，continuous culture，dilution rate，γ-aminobutyric acid

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者)。

2010－07－15，改回日期:2010－10－12