海藻酸鈉明膠及戊二醛協(xié)同固定化莧菜脂氫過氧化物裂解酶*

薛慶海，徐梁，沐萬孟，江波，華欲飛

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122)

海藻酸鈉明膠及戊二醛協(xié)同固定化莧菜脂氫過氧化物裂解酶*

薛慶海1，2，徐梁2，沐萬孟1，江波1，華欲飛2

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122)

采用海藻酸鈉明膠協(xié)同包埋、同時使用戊二醛交聯(lián)制備固定化莧菜脂氫過氧化物裂解酶，考察了海藻酸鈉、明膠濃度、CaCl2濃度、交聯(lián)劑戊二醛濃度及交聯(lián)時間等因素對固定化脂氫過氧化物裂解酶的影響;比較了固定化酶與游離酶的酶學性質(zhì)。結果表明，制備固定化脂氫過氧化物裂解酶的最優(yōu)條件為:海藻酸鈉、明膠濃度分別為1.25%和0.5%，CaCl2濃度為8%，戊二醛濃度為1%，交聯(lián)時間為20 min。固定化酶的最適溫度、最適pH略有提高;溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及貯藏穩(wěn)定性顯著提高。

海藻酸鈉，明膠，戊二醛，脂氫過氧化物裂解酶，固定化，酶學性質(zhì)

脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase，HPL)是植物脂氧化途徑中脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)下游的酶，催化LOX的反應產(chǎn)物——脂氫過氧化物裂解生成短鏈揮發(fā)性醛(主要為己醛、己烯醛)和含氧酸［1］。HPL的催化產(chǎn)物(六碳醛及醛醇)是果實、蔬菜和綠葉特征風味的重要組成成分，因此可作為食品的添加劑，恢復果蔬的芳香風味;這些風味物質(zhì)也被廣泛地應用于香水和化妝品制造產(chǎn)業(yè)中，具有很高的經(jīng)濟價值［2］。

HPL活性中心存在半胱氨酸殘基，其巰基易被氧化，因此該酶在儲存過程中容易失活;底物脂氫過氧化物對HPL的活性存在抑制作用［3］，尤其是高濃度的底物;HPL的催化產(chǎn)物之一——2-E-己烯醛通過與活性中心的巰基反應而抑制其活性［4］。綜上所述，HPL不穩(wěn)定，容易失活;而酶經(jīng)固定化后，它的三級結構變得穩(wěn)定，再加上抗干擾因素的存在，對抑制劑敏感性降低，從而酶的穩(wěn)定性得到提高，更適于在工業(yè)中使用。關于HPL固定化方面的研究很少，Rehbock等人［5］研究了綠豆HPL的共價固定化，固定化HPL可以反復使用4次，其儲藏穩(wěn)定性明顯高于游離酶。

本文研究了海藻酸鈉明膠協(xié)同包埋、同時使用戊二醛交聯(lián)制備固定化莧菜HPL的條件，以期得到穩(wěn)定性較高的固定化酶，為工業(yè)化應用該酶生產(chǎn)芳香物質(zhì)(揮發(fā)性醛類)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

莧菜，購于無錫本地市場。

1.1.2 主要試劑

聚乙烯吡咯烷酮(PVP K－30)、海藻酸鈉、明膠、Na2HPO4、NaH2PO4、Triton X－100、二硫蘇糖醇(DTT)、戊二醛、CaCl2等，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器設備

Centrifuge 5804R冷凍離心機，德國EPPENDORF公司;Cary50紫外可見分光光度儀，美國VARIAN公司;TGL-16G臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;5HZ-DIII型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市英峪儀器廠;DK-8D型電熱恒溫水浴槽，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 莧菜HPL粗酶液的制備

取一定質(zhì)量的莧菜洗凈去根莖，加入0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)以及質(zhì)量濃度為0.5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP K－30)，勻漿，過濾;濾液冷凍離心，以pH 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，然后用0.02mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液(含質(zhì)量濃度為0.5%的 Triton X－100，1 mmol/L DTT)溶解，混勻，冷凍離心，上清液即為粗酶液。

1.2.2 莧菜HPL固定化方法

配制一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉、明膠混合溶液10mL，加人10mL粗酶液，充分混勻，用注射器滴人到一定濃度的CaCl2溶液中，浸泡20 min后，真空抽濾，用蒸餾水洗滌凝膠表面Ca2+，置于一定濃度的戊二醛中交聯(lián)一段時間，洗滌，真空抽濾，4℃保藏備用。

1.3 酶活測定方法

1.3.1 游離酶酶活測定

HPL催化底物13－HPOT(13位的亞麻酸氫過氧化物)的制備參考文獻［6］中的方法。

以13-HPOT為反應底物，反應體系為10μL粗酶液、10μL底物，用0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)稀釋至3mL。使用紫外分光光度計檢測234 nm處吸光值的降低來測定HPL酶活。酶活力單位定義為:25℃，每分鐘消耗1 μmol的13-HPOT所需的酶量為1個活力單位(U)。

1.3.2 固定化酶酶活測定

取0.02 g固定化酶，加入2 990μL pH 6.5的磷酸鹽緩沖液與10μL 13-HPOT反應3 min，沸水浴滅活10 min，離心取上清液;對照組先滅活再加入10μL 13-HPOT，離心取上清液;通過測定兩者在234 nm吸光值的差值來測定固定化酶的酶活。酶活單位U定義同1.3.1。

1.3.3 酶活回收率的計算

2 結果與討論

2.1 莧菜HPL固定化條件的確定

2.1.1 海藻酸鈉和明膠濃度對固定化的影響

取不同質(zhì)量濃度的海藻酸鈉、明膠混合溶液，加人粗酶液，充分混勻，用注射器滴人到一定濃度的CaCl2溶液中，浸泡20 min后，真空抽濾，用蒸餾水洗滌凝膠表面Ca2+，置于一定濃度的戊二醛中交聯(lián)，洗滌，真空抽濾，測定固定化HPL的酶活和酶活回收率，結果見表1。

表1 海藻酸鈉和明膠濃度對莧菜HPL固定化的影響

由表1可知，當明膠濃度為0.5%時，隨著海藻酸鈉濃度的增加，固定化酶的酶活力、酶活回收率不斷增加;但當明膠濃度分別為1%和1.25%時，酶活、酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的增加而下降，并且因海藻酸鈉濃度太高，滴定的凝膠難以形成規(guī)則圓形，這是因為高濃度的海藻酸鈉與明膠無法混勻。綜合考慮以上各因素，固定化莧菜HPL時，海藻酸鈉與明膠濃度分別為1.25%和0.5%為宜［注:粗酶液酶活為(1.98±0.018)U/mL］。

2.1.2 CaCl2濃度對固定化的影響

取最佳濃度的海藻酸鈉與明膠混合溶液，加入粗酶液，混合均勻，用注射器滴到不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液中，浸泡20 min，真空抽濾，用蒸餾水洗滌凝膠表面Ca2+置于一定濃度的戊二醛中交聯(lián)，洗滌，真空抽濾，測定固定化HPL的酶活及酶活回收率，結果如圖1所示(注:粗酶液酶活為1.58±0.019 U/mL)。

圖1 CaC12濃度對莧菜HPL固定化的影響

由圖1可知，固定化酶的酶活力、酶活回收率在CaCl2濃度為8%時達到最大。當CaC12濃度在2%～8%變化時，隨著濃度的增加，浸泡液中可與海藻酸鈉結合的Ca2+含量增加，可以形成更致密的凝膠結構［7］，這樣酶分子被包埋得越牢固，不易脫落，所以固定化酶的酶活力和酶活回收率隨著CaCl2濃度的增加而增大;CaCl2濃度繼續(xù)增加，酶活力和酶活回收率反而減小，可能是因為高濃度的Ca2+對酶有破壞作用。因而確定，CaCl2的適宜濃度為8%。

2.1.3 戊二醛濃度對固定化的影響

取最佳濃度的海藻酸鈉與明膠混合溶液，加入粗酶液，混合均勻，用注射器滴到8%的CaCl2溶液中，浸泡20 min，真空抽濾，用蒸餾水洗滌凝膠表面Ca2+置于不同體積分數(shù)的戊二醛中交聯(lián)，洗滌，真空抽濾，測定固定化HPL的酶活力及酶活回收率，結果如圖2所示［注:粗酶液酶活為(1.15±0.023)U/mL］。

圖2 戊二醛濃度對莧菜HPL固定化的影響

由圖2可以看出，當戊二醛濃度較低(0.5%，0.75%)時，固定化HPL的酶活力、酶活回收率較不使用戊二醛交聯(lián)的固定化酶低，可能是因為HPL的催化活性受到戊二醛的影響，同時低濃度的戊二醛并不能很好地交聯(lián)酶分子;當戊二醛濃度為1%時，酶活回收率達到最大，而且比未使用其交聯(lián)的還大，是因為雖然戊二醛對HPL的催化活性有負面的影響，但此濃度的戊二醛在HPL分子間起到了很好的交聯(lián)作用，使得固定化的HPL分子更多;戊二醛濃度繼續(xù)升高，酶活回收率下降，是因為HPL的催化活性受到戊二醛的影響，同時高濃度的戊二醛容易產(chǎn)生酶分子內(nèi)部的交聯(lián)［8］，從而可能改變酶活性位點的構象。

2.1.4 戊二醛交聯(lián)時間對固定化的影響

取最佳濃度的海藻酸鈉與明膠混合溶液，加入粗酶液，混合均勻，用注射器滴到8%的CaCl2溶液中，浸泡20 min，真空抽濾，用蒸餾水洗滌凝膠表面Ca2+置于1%的戊二醛中交聯(lián)不同的時間，洗滌，真空抽濾，測定固定化HPL的酶活及酶活回收率，結果如圖3所示［注:粗酶液酶活為(0.97±0.015)U/mL］。

圖3 戊二醛交聯(lián)時間對固定化HPL的影響

由圖3可知，當戊二醛交聯(lián)時間為20 min時，固定化HPL的酶活、酶活回收率達到最高。這說明，短時間的交聯(lián)，對莧菜HPL并不能起到很好的交聯(lián)作用;而時間過長，有可能引起HPL分子內(nèi)部的交聯(lián)，從而改變酶分子活性中心的構象。所以，交聯(lián)時間選擇20 min。

2.2 固定化HPL的酶學性質(zhì)

2.2.1 固定化HPL的最適pH值

在30℃條件下，分別在pH值4.0～8.0的緩沖液中測定固定化酶和游離酶的酶活力，分別以最適pH值條件下的固定化酶酶活力、游離酶酶活為100%作圖，如圖4所示。

圖4 pH值對固定化HPL和游離HPL活性的影響

由圖4可知，游離酶的最適作用pH值為6.0，而固定化酶的最適pH值稍有提高，為6.5，而且固定化酶有著更寬的pH值范圍。

2.2.2 固定化HPL的最適溫度

在pH值6.0的條件下，分別在20～70℃測定固定化酶和游離酶的酶活力，分別以最適溫度下的固定化酶酶活力、游離酶酶活為100%做圖，結果見圖5。游離酶的最適溫度為30℃，固定化酶的最適溫度提高到了35℃，溫度提高了有利于提高轉化率，這對工業(yè)應用很有利。

圖5 溫度對固定化HPL和游離HPL的影響

2.2.3 固定化HPL的pH值穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶在pH值4.0～8.0的0.05mol/L的緩沖液中放置1 h，分別在各自的最適pH、最適溫度下測定酶活;分別以未處理的固定化酶和游離酶酶活力為100%作圖，結果如圖6所示。游離酶在pH值5.5～7.0較穩(wěn)定;固定化HPL在pH值5.0～7.5較穩(wěn)定，且穩(wěn)定性高于游離HPL。

圖6 pH對固定化HPL和游離HPL穩(wěn)定性的影響

2.2.4 固定化HPL的溫度穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶在不同溫度(20～70℃)下保溫1 h，分別在各自的最適pH、最適溫度下測定酶活力;分別以未處理的固定化酶和游離酶的酶活為100%作圖(圖7)，游離酶在20～35℃穩(wěn)定性較高，殘余酶活均在80%以上;固定化酶在20～40℃穩(wěn)定性高，殘余酶活在80%以上，整個溫度范圍內(nèi)，固定化HPL的穩(wěn)定性均優(yōu)于游離HPL，這是因為游離酶經(jīng)固定化后，蛋白質(zhì)分子被固定在凝膠顆粒中，分子整體運動受阻，活性中心的穩(wěn)定性也隨之增加。

圖7 溫度對固定化HPL和游離HPL穩(wěn)定性的影響

2.2.5 固定化HPL的使用批次

固定化酶的操作穩(wěn)定性，即使用批次，決定著固定化酶應用的效率和成本，是衡量固定化效果的重要指標。取0.02 g固定化酶，在最適pH值、最適溫度下反應3 min，將固定化酶濾出，用緩沖溶液沖洗固定化酶3次，然后用于下一批反應，如此重復6次，結果如圖8所示。從圖8可以看出，在第1次使用后體系的酶活有一定程度的下降，殘余酶活在80%左右，使用6次后，殘余酶活不足20%。固定化HPL的操作穩(wěn)定性并不很好，是由于 HPL本身的性質(zhì)引起的——HPL的催化底物脂氫過氧化物對HPL的抑制是不可逆轉的［5］。

圖8 固定化HPL的使用批次

2.2.6 固定化HPL的貯藏穩(wěn)定性

由圖9可以看出，固定化HPL的貯藏穩(wěn)定性明顯高于游離HPL。在4℃儲藏12 d后，固定化酶還有60%左右的酶活，而游離酶只剩40%;儲藏24 d后，固定化酶保持著30%左右的酶活，而游離酶酶活已不足10%。

圖9 固定化HPL和游離HPL的貯藏穩(wěn)定性

3 結論

使用海藻酸鈉明膠協(xié)同包埋莧菜HPL，并使用戊二醛交聯(lián)，得到了較好的固定化效果。海藻酸鈉明膠及戊二醛協(xié)同固定化莧菜HPL的適宜條件為:海藻酸鈉、明膠濃度分別為1.25%和0.5%，CaCl2濃度為8%，戊二醛濃度為1%，交聯(lián)時間為20 min。

相比游離酶，固定化HPL的最適pH值提高到6.5，更接近中性，這樣可以直接在純水中進行酶反應而無需調(diào)pH值;最適溫度由30℃提高到35℃;pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性都高于游離HPL;固定化HPL可以多次反復使用。所有這些都為工業(yè)化應用HPL生產(chǎn)芳香成分(揮發(fā)性醛類物質(zhì))提供了便利。

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Immobilization of Hydroperoxide Lyase from Amaranthus tricolor with Sodium Alginate-gelatin and Glutaraldehyde

Xue Qing-hai1，2，Xu Liang2，Mu Wan-meng1，Jiang Bo1，Hua Yu-fei2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(School of Food Science＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

A method for immobilizing Hydroperoxide lyase(HPL)from Amaranthus tricolor with sodium alginate，gelatin and glutaraldehyde was presented.The optimal conditions for the immobilization of the enzyme were as follows:concentration of sodium alginate，gelatin and CaCl2was 1.25%，0.5%and 8%respectively;concentration of the crosslinking agent(glutaraldehyde)was 1%and the crosslinking time was 20 min.Compared with the free HPL，the optimal temperature and optimal pH of the immobilized enzyme increased to some extent，while the thermal stability，pH stability and storage stability increased greatly.

sodium alginate，gelatin，glutaraldehyde，hydroperoxide lyase，immobilization，enzymatic characterization

碩士研究生(江波教授為通訊作者)

* 科技部“863”計劃資助項目(2008AA10Z305);江南大學食品學院青年博士科研創(chuàng)新開放基金(FS－200806)

2010－06－25，改回日期:2010－08－07