多元線性回歸設(shè)計(jì)玉米須β-谷甾醇的提取

趙文竹,于志鵬,于一丁,劉靜波

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長(zhǎng)春 130062)

多元線性回歸設(shè)計(jì)玉米須β-谷甾醇的提取

趙文竹,于志鵬,于一丁,劉靜波＊

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長(zhǎng)春 130062)

建立了玉米須β-谷甾醇測(cè)定方法及熱回流提取的多元線性回歸模型,實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溫度、時(shí)間、液固比及乙醇濃度對(duì)β-谷甾醇含量的影響,并通過多元線性回歸設(shè)計(jì)了熱回流提取模型。結(jié)果表明,β-谷甾醇測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠,可以用于玉米須中的β-谷甾醇的測(cè)定。同時(shí)乙醇提取玉米須β-谷甾醇多元線性回歸模型顯著,不失擬。玉米須β-谷甾醇的最佳工藝參數(shù)為提取溫度 45℃、時(shí)間 80min、液固比 25∶1、乙醇濃度 75%,其中β-谷甾醇的提取率可達(dá)1.52%。

玉米須β-谷甾醇,紫外檢測(cè),熱回流提取,多元線性回歸設(shè)計(jì)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

玉米須 分別采摘自吉林省九臺(tái)、四平、德惠地區(qū),由吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室提供;硼酸 (H3BO3)、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、氫氧化鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙醇、氯仿等分析純?cè)噭?北京化工廠;葡萄糖 (Glc)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)SIG MA公司。

表1 因素編碼表

F W-200高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;CS-501超級(jí)恒溫水浴鍋 上海東榮豐科儀器有限公司;752-PC紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;QSY凱氏定氮儀 北京強(qiáng)盛分析設(shè)備有限公司;ZF-06脂肪測(cè)定儀 上海瑞正儀器設(shè)備有限公司;DZF-6050遠(yuǎn)紅外干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;AG204分析天平 瑞士METT LER T OLEDO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米須營(yíng)養(yǎng)成分分析 蛋白質(zhì)的測(cè)定：微量凱氏定氮法《GB/T 5009.5-2003》;還原糖的測(cè)定：直接滴定法《GB/T5009.7-1985》;脂肪的測(cè)定：索氏提取法《GB/T 5009.6-2003》;水分的測(cè)定：直接稱量法《GB/T 10362-1989》;灰分的測(cè)定：高溫爐炭化法《GB/T 12086-1989》。

1.2.2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.2.2.1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取 18mg β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品,用氯仿定容到 10mL為對(duì)照液(濃度為 1.8mg/mL)。用刻度移液管分別準(zhǔn)確量取對(duì)照液 0、0.3、0.5、1、1.2、1.5、2、2.5mL于 5mL容量瓶中,濃度分別是 0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9mg/mL加氯仿至刻度,搖勻。

1.2.2.2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將對(duì)照液以氯仿為空白,在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔10nm測(cè)定一次吸光值。根據(jù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制掃描圖。在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),以濃度為橫坐標(biāo),繪制β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 玉米須β-谷甾醇檢測(cè)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為 0.54mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng) 6次取樣后在 243nm處測(cè)其吸光度值,考察測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。

1.2.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取九臺(tái)地區(qū)玉米須原料 (過60目篩)5g,精密稱定,按供試品溶液制備方法平行制備樣品供試液6份,濃縮后用氯仿定容至5mL。各取 3mL,在243nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取處理好的九臺(tái)地區(qū)玉米須樣品溶液 3mL,于 243nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定,分別考察了 1、2、3、4、5、6h玉米須提取液β-谷甾醇的含量,從而考察了測(cè)定方法的穩(wěn)定性。

1.2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取 0.8mL濃度為0.43mg/mL的β-谷甾醇對(duì)照品溶液 6份,分別加入6份已知β-谷甾醇吸光度為 0.187,即β-谷甾醇粗提物的含量為 1.25%的九臺(tái)地區(qū)玉米須提取液,在243nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。

1.2.4 熱回流法提取β-谷甾醇 實(shí)驗(yàn)采用多元線性回歸設(shè)計(jì)熱回流提取九臺(tái)地區(qū)玉米須β-谷甾醇,分別考察乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度四個(gè)因素,每個(gè)因素平行測(cè)定三次。

1.2.4.1 溫度對(duì)β-谷甾醇含量的影響 在液固比為20∶1,提取時(shí)間為 90min,顆粒度為 60目,及 75%濃度乙醇時(shí),對(duì)比分析在 40、50、60、70、80、90℃六個(gè)溫度條件下的甾醇物質(zhì)含量,以確定最佳的提取溫度。

1.2.4.2 時(shí)間對(duì)β-谷甾醇含量的影響 選擇液固比為 20∶1,顆粒度為 60目,提取溫度為 50℃及 75%乙醇濃度的條件下,對(duì)比分析 30、60、90、120、150、180min六個(gè)不同提取時(shí)間實(shí)驗(yàn)條件下甾醇的含量,以確定最佳的提取時(shí)間。

1.2.4.3 液固比對(duì)β-谷甾醇含量的影響 選擇顆粒度為60目及75%的乙醇濃度、時(shí)間一定的條件下,對(duì)比分析液固比為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1六個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下玉米須甾醇含量,以確定適宜的液固比。

1.2.4.4 乙醇濃度對(duì)β-谷甾醇含量的影響 選擇液固比為 20∶1,顆粒度為 60目,提取溫度為 50℃,提取時(shí)間 90min,對(duì)比分析了 45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇濃度對(duì)玉米須甾醇類物質(zhì)含量的影響,以確定最優(yōu)乙醇濃度。

1.2.5 多元線性回歸模型建立[14]通過上述單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最優(yōu)提取條件,為了進(jìn)一步考察β-谷甾醇含量與提取溫度、提取時(shí)間、液固比、乙醇濃度的關(guān)系,擬采用多元線性回歸設(shè)計(jì)方法求其定量關(guān)系,各因素實(shí)驗(yàn)考察的范圍是：z1：40～60℃,z2：80～100min, z3：20∶1～40∶1,z4：75%～95%。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米須中基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定結(jié)果分析

表 2 三個(gè)產(chǎn)地玉米須中基本營(yíng)養(yǎng)成分的含量

玉米須β-谷甾醇主要存在油脂中,通過營(yíng)養(yǎng)素成分測(cè)定可知,九臺(tái)、四平、德惠地區(qū)的玉米須脂肪含量分別為 1.64%、1.03%、0.59%,九臺(tái)和德惠地區(qū)玉米須脂肪含量具有明顯差異性,這表明玉米須中各營(yíng)養(yǎng)成分的含量多少與其產(chǎn)地有關(guān)。實(shí)驗(yàn)選擇九臺(tái)地區(qū)玉米須作為實(shí)驗(yàn)原料,考察β-谷甾醇的提取工藝。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

玉米須提取液經(jīng)濃縮后,用氯仿定容至 10mL的容量瓶,以氯仿為空白液,在 200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)經(jīng)紫外分光光計(jì)每隔 10nm測(cè)定一次吸光值,以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo)繪制掃描圖。標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定方法與樣品液測(cè)定方法相同。如圖 1、圖 2所示,β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品與玉米須提取液均在 243nm處有最大吸收峰,這表明玉米須提取液中存在β-谷甾醇,并且最大吸收峰為 243nm。

圖1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖

圖2 β-谷甾醇提取液掃描圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取濃度為 0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9、1.8mg/mL的β-谷甾醇對(duì)照品在 243nm處測(cè)吸光度,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖 3所示。得回歸方程 y=0.5378x-0.0017,R2=0.9934,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

圖3 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 玉米須β-谷甾醇測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)玉米須β-谷甾醇檢測(cè)方法進(jìn)行精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性及回收率的測(cè)定,如表 3可知,β-谷甾醇測(cè)定方法的精密度高,重現(xiàn)性良好,穩(wěn)定性較高,回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 玉米須β-谷甾醇的提取

2.5.1 提取溫度對(duì)β-谷甾醇含量的影響 提取溫度為橫坐標(biāo),β-谷甾醇的含量為縱坐標(biāo),得到提取溫度與β-谷甾醇含量變化的關(guān)系曲線,由圖4可知,隨著提取溫度的升高,甾醇的提取含量增大,當(dāng)溫度升到 50℃時(shí),甾醇提取含量達(dá)到最大值,隨著溫度的增加,甾醇的提取含量逐漸下降,可能是由于溫度過高時(shí)導(dǎo)致甾醇的環(huán)戊烷并多菲結(jié)構(gòu)破壞,因此在以氯仿為溶劑,以 243nm為檢測(cè)波長(zhǎng)在紫外區(qū)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),含量減少。

表 3 玉米須β-谷甾醇方法學(xué)驗(yàn)證

圖 4 提取溫度對(duì)β-谷甾醇含量的影響

2.5.2 提取時(shí)間對(duì)β-谷甾醇含量的影響 β-谷甾醇的含量與提取時(shí)間的關(guān)系由圖 5可知,是逐漸升高后又逐漸降低的過程,在提取溫度控制在 50℃時(shí),提取時(shí)間為 90min,甾醇的含量最大,低于 90min,提取不完全,高于 90min,部分甾醇將有可能被破壞,原因可能是當(dāng)提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生過高溫度,使甾醇活性成分濕熱降解或異構(gòu)化,導(dǎo)致提取物有效成分含量降低,因此提取時(shí)間以 90min為宜。

圖 5 提取時(shí)間對(duì)β-谷甾醇含量的影響

2.5.3 液固比對(duì)β-谷甾醇類物質(zhì)含量的影響 固定樣品量,改變提取溶劑量,由圖 6知,在一定范圍內(nèi),提取溶劑量越大,即液固比越大,甾醇含量就越高。當(dāng)液固比為 30∶1時(shí),可以把大部分甾醇提取出來,隨著液固比的繼續(xù)增大,提取量提高不明顯。為節(jié)約成本減少回收溶劑帶來的困難,選擇液固比為30∶1為宜。

圖 6 液固比對(duì)β-谷甾醇含量的影響

2.5.4 乙醇濃度對(duì)β-谷甾醇含量的影響 乙醇作為玉米須β-谷甾醇的提取溶劑,濃度的大小決定了溶液極性的高低。由圖 7知,隨著乙醇濃度的增大,甾醇的提取含量逐漸變大,當(dāng)乙醇濃度大于 75%時(shí),甾醇的提取含量變化緩慢,但仍保持上升趨勢(shì),因此選擇85%的乙醇濃度為最優(yōu)提取條件。且在85%的乙醇提取條件下,一些水溶性的極性成分,如蛋白質(zhì)、果膠、樹膠、多糖類等溶解度變小,使其從提取液中沉淀出來,利于有效成分的富集。由于 100%的乙醇與石油醚互溶,因此未以 100%的乙醇作為提取劑。

表4 多元線性回歸方案及計(jì)算表

圖 7 乙醇濃度對(duì)β-谷甾醇含量的影響

2.5.5 回歸模型的驗(yàn)證 在單因素所確定的最佳參數(shù)范圍的基礎(chǔ)上,以β-谷甾醇含量作為考察的指標(biāo),利用多元線性回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化參數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。對(duì)所得到的熱回流法提取β-谷甾醇含量的多元線性回歸設(shè)計(jì)進(jìn)行三項(xiàng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2.5.5.1 回歸系數(shù)檢驗(yàn) 各因素及交互作用的回歸系數(shù)統(tǒng)計(jì)量 Fj及顯著性水平見表 4所示,通過最小二乘法求回歸系數(shù)可知,回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)分別為 b0=0.97,b1=-0.06,b2=0.05,b3=0.01,b4= -0.27,交互作用相的系數(shù)為 b12=-0.10,由回歸系數(shù)檢驗(yàn)可知,提取溫度、提取時(shí)間、液固比均為不顯著因素,乙醇濃度為顯著性因素,顯著性水平為 0.05,提取溫度和提取時(shí)間的交互作用為顯著性因素,顯著水平為 0.25。

2.5.5.2 回歸方程的顯著性檢驗(yàn) 對(duì) Fj＜1的項(xiàng)不進(jìn)行檢驗(yàn),直接從回歸方程中剔除,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中x1x2交互作用項(xiàng)的系數(shù) b12的顯著性水平為 0.25,考慮到 Fj更接近于 F0.25(1,2)=2.57,因此將其剔除。所得到的回歸方程如式 Y=0.97-0.27x4,回歸偏差平方和 S回=0.686,剩余偏差平方和 SR=0.06547,按式計(jì)算可知 F回=10.47＞F0.05(5,5)=5.05。F檢驗(yàn)表明,方程的顯著水平為 0.05?；貧w方程的顯著性檢驗(yàn)見公式(1)。

2.5.5.3 失擬檢驗(yàn) 失擬平方和 Slf=0.014,誤差平方和 Se=0.051,由式可知 Flf=0.1854。統(tǒng)計(jì)量 Flf＜1,則表明已求得方程是不失擬的,即擬合的較好。見公式(2)。

2.5.5.4 回歸方程的變換 將各因素的編碼公式帶入自然空間中得回歸方程如下：Y=3.265-0.027Z4。該回歸方程在乙醇濃度為 75%～95%范圍內(nèi)指標(biāo)值顯著,由方程可知隨著乙醇濃度的減少,β-谷甾醇的含量越大,當(dāng)乙醇濃度為 75%時(shí),Y=3.244,實(shí)驗(yàn)考察其他各因素均為不顯著性因素,因此從實(shí)驗(yàn)可操作性、經(jīng)濟(jì)性、浪費(fèi)少等角度選擇實(shí)驗(yàn)條件為溫度45℃、時(shí)間 80min、液固比為 25∶1,因此經(jīng)多元線性回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化出熱回流乙醇提取β-谷甾醇方法的最優(yōu)工藝為：提取溫度 45℃、時(shí)間 80min、液固比 25∶1、乙醇濃度75%。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析了九臺(tái)、四平、德惠地區(qū)的玉米須營(yíng)養(yǎng)素成分,通過測(cè)定可知,三個(gè)地區(qū)玉米須脂肪含量具有差異性,這表明玉米須中各營(yíng)養(yǎng)成分的含量多少與其產(chǎn)地有關(guān)。建立了紫外分光光度法測(cè)定玉米須β-谷甾醇含量的實(shí)驗(yàn)方法,經(jīng)測(cè)定可知,該方法較為準(zhǔn)確,且精密度高,重現(xiàn)性良好,穩(wěn)定性較高,回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合實(shí)驗(yàn)要求。

通過單因素實(shí)驗(yàn),考察了提取溫度、時(shí)間、液固比及乙醇濃度對(duì)玉米須β-谷甾醇含量的影響,并在最優(yōu)提取參數(shù)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了多元線性回歸實(shí)驗(yàn)。經(jīng)回歸系數(shù)檢驗(yàn)、回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及失擬性檢驗(yàn)后,乙醇濃度和提取溫度及時(shí)間的交互作用為顯著性因素,顯著性水平分別為 0.05和 0.25,并且回歸方程顯著且不失擬。熱回流乙醇提取β-谷甾醇方法的最優(yōu)工藝為,提取溫度 45℃、時(shí)間 80min、液固比25∶1、乙醇濃度 75%,此時(shí)β-谷甾醇含量為 1.52%。

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Extraction ofβ-sitosterol from stigm a m aydis by m ultiple linear regression design

ZHAO W en-zhu,YU Zhi-peng,YU Y i-ding,L IU Jing-bo＊
(Laboratory ofNutrition and Functional Food,College ofQuarter master Technology,JilinUniversity,Changchun 130062,China)

O b jec tive to es tab lish the assay m e thod of s tigm a m ayd isβ-s itos te rol content and m ult ip le linea r reg ress ion m ode l of the hot backs tream ing extrac ting.The re la tionship was s tud ied be tween theβ-s itos te rol contentw ith the fac tors of extrac t temp e ra ture,extrac t t im e,a lcohol concentra tion,the ra tio of dosage liquor.The extrac ting m ode l was des igned by m ult ip le linea r reg ress ion.The results showed tha t the fac tor of the a lcohol concentra tion was s ignificant and the m ode lwas not lack fit.The bes t extrac ting technology was45℃,80m in,75% of the a lcohol concentra tion,the ra tio of solid to liquid was25∶1,and the extrac ting ra tio ofβ-s te rolwas1.52%.

s tigm a m ayd isβ - s itos te rol;UV de tec tion; hotbacks tream ing extrac ting;m ult ip le linea r reg ress ion des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0306-05

甾醇因其呈固態(tài)又稱為固醇,如膽固醇、谷固醇等,廣泛存在于各種谷類、糧食中,并且在糙米中的植物甾醇含量很高[1]?，F(xiàn)已鑒別出天然甾醇 160種,據(jù)來源不同也可分為植物甾醇、動(dòng)物甾醇和菌類甾醇三大類。植物甾醇主要有谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇,主要存在于植物的油脂中[2],植物甾醇是一種類似于環(huán)狀醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[3],谷甾醇和豆甾醇的 R基是乙基,而谷甾醇沒有側(cè)鏈上的雙鍵。甾醇主要存在于油類物質(zhì)的不皂化物中,不同植物油中所含的植物甾醇是不一樣的。植物甾醇具有降低膽固醇[4-5]、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]、防止前列腺肥大[7]及調(diào)節(jié)血脂[8]等功效,是當(dāng)前世界甾體藥物迫切需要的重要藥源。植物甾醇和植物甾醇衍生物由于其特有的生物學(xué)特性和理化特性[9]被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料[10]等行業(yè)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)β-谷甾醇的檢測(cè)大部分采用樣品中加入濃硫酸和醋酸酐顯色[11],利用可見分光光度計(jì)測(cè)定或 HPLC法[12],但由于醋酸酐為毒品不易購買,HPLC測(cè)定法操作繁瑣,且實(shí)驗(yàn)花銷較大,因此玉米須β-谷甾醇的測(cè)定在前人的基礎(chǔ)上,采用不加顯色劑,在紫外光下測(cè)定甾醇含量[13],并建立可靠的測(cè)定方法。本文通過熱回流提取工藝,對(duì)玉米須中β-谷甾醇進(jìn)行提取,通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)提取參數(shù),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多元線性回歸設(shè)計(jì),得出最佳實(shí)驗(yàn)方法,為玉米須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2009-10-12 ＊通訊聯(lián)系人

趙文竹 (1986-),女,碩士研究生,研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品。