楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,張 英,吳曉琴

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310029)

楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,張 英,吳曉琴＊

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310029)

采用DPPH法、ABTS法、Rancimat法及血液體系總抗氧化能力測(cè)定法研究楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明,楊梅葉、枝和樹皮提取物清除DPPH·、ABTS+·能力顯著強(qiáng)于陽性對(duì)照。楊梅枝提取物清除DPPH·能力最強(qiáng),為 1907.5±6.40mg TEAC/g,葉次之,皮最弱;楊梅葉提取物清除 ABTS+·能力最強(qiáng),為 1692.90±31.81mg TEAC/g,枝次之,皮最弱。提取物對(duì)山茶油的抗氧化能力與其添加劑量呈量效關(guān)系,在 0.02%添加劑量下,各提取物對(duì)山茶油的抗氧化能力表現(xiàn)為 TBHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。血液體系總抗氧化能力從強(qiáng)到弱的排序依次為VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

抗氧化活性,DPPH·,ABTS+·,山茶油

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺楊梅葉、枝和樹皮 2007年 7月份采于浙江余姚,40℃烘干,粉碎后過 20目篩;鮮榨山茶油; DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、ABTS[2,2′-azino-bis-(3-ehyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)、Trolox Sigma,美國(guó);總抗氧化能力試劑盒 南京建成生物工程研究所;過硫酸鉀、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、維生素 E、維生素 C、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、福林-酚試劑、碳酸鈉、蘆丁、楊梅素、沒食子酸、無水乙醇、甲醇等 均為分析純?cè)噭?/p>

Ranc imat743食用油脂氧化穩(wěn)定性測(cè)定儀 瑞士Metrohm公司;TU-1810紫外-可見 (UV-V IS)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;FA1004型電子天平 (萬分之一) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;R-201型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楊梅葉、枝和樹皮有效成分的提取 采用70%乙醇熱回流浸提楊梅葉、枝和樹皮中有效成分。浸提溫度為 80℃,料液比為 1∶10,回流提取 2次,每次 2h,除去殘?jiān)笮D(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。濃縮液溶于一定量水中,用石油醚除去蠟質(zhì)、色素、油脂等弱極性物質(zhì),再以 1∶3溶劑量的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取物,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,經(jīng)冷凍干燥分別得到楊梅葉、枝和樹皮提取物(MLE、MBR、MBA)樣品,放入干燥器中備用。

1.2.2 DPPH·清除能力測(cè)定 在Bao等[5]所建立方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良,配制質(zhì)量濃度為 0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mg/L的 Trolox溶液,分別取 50μL與5mL濃度為 1×10-4mol/L的 DPPH·甲醇溶液混合測(cè)定 517nm處的吸光值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一定濃度的樣品甲醇溶液,樣品的測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)曲線,以不加樣品的DPPH·甲醇溶液為空白,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。自由基清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Acontrol為空白的吸光值;Asample為樣品吸光值。

1.2.3 ABTS+·清除能力測(cè)定 先將ABTS溶于甲醇中制備成 7mmol/L的儲(chǔ)備液,然后取 5mL ABTS儲(chǔ)備液和 88μL 140mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,得到 2.45mmol/L的ABTS+·貯備液;將該溶液于 20℃下避光放置 12～16h。最后將生成的 ABTS+·儲(chǔ)備液用甲醇稀釋,使其在 734nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.70±0.02,即得到ABTS+·工作液。

參考 Re[6]等和 Cai[4]等的方法,配制濃度為 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mmol/L的 Trolox溶液,分別取40μL與 4mL ABTS+·溶液混合,搖勻,6min后于734nm下測(cè)定其吸光值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一定濃度的樣品甲醇溶液,樣品的測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)曲線,以不加樣品的溶液為空白,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。自由基清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Acontrol為空白的吸光值;Asample為樣品吸光值。

1.2.4 對(duì)油脂抗氧化能力測(cè)定 采用 Ranc imat法,其基本原理是基于向一定溫度的油樣中通入一定流量的空氣,使油樣加速氧化,將氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性小分子(如醛、酮、酸等)導(dǎo)入裝有蒸餾水的瓶中,記錄瓶中水的電導(dǎo)率變化情況,并求出誘導(dǎo)時(shí)間,記為I p。誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng),表明油樣抗氧化穩(wěn)定性越好。

參考 Sun等[7]的方法,分別取 3g油樣至Ranc imat儀的樣品管,調(diào)節(jié)空氣流量為 20L/h,設(shè)定溫度為 120℃。準(zhǔn)確稱取楊梅葉、枝和樹皮提取樣品,用少量甲醇溶解,并將其加入到山茶油樣品中,配制成樣品添加量分別為 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的油樣。以山茶油中添加相應(yīng)量的溶解樣品的溶劑為空白,以相同劑量的 TBHQ、VE為陽性對(duì)照,分別測(cè)定空白、陽性對(duì)照和提取樣品對(duì)山茶油的誘導(dǎo)時(shí)間,并計(jì)算各陽性對(duì)照和試樣的相對(duì)抗氧化能力,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

1.2.5 全血體系總抗氧化能力測(cè)定 原理：利用抗氧化物質(zhì)能使 Fe3+還原成 Fe2+,后者可與斐林類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物的性質(zhì),從而可以通過比色法測(cè)定受試樣品在全血體系中抗氧化能力的強(qiáng)弱。

取一定量的血清,取一定濃度的樣品,按照總抗氧化能力試劑盒 (T-AOC)操作說明進(jìn)行測(cè)試。以VC作為陽性對(duì)照。全血總抗氧化能力(T AC)計(jì)算方法如下：

其中,V0=3.8mL,V1=0.1mL;A1為加入提取物后反應(yīng)體系的吸光度;A0為空白反應(yīng)體系吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用 Excel和 SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有樣品均平行測(cè)定三次,測(cè)定結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示,顯著性界值 p=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除DPPH·能力

DPPH法[8]自上世紀(jì)五十年代開始就用于天然產(chǎn)物的 H-供體的測(cè)定,后用于單一抗氧化物或天然物質(zhì)的抗氧化能力測(cè)試。DPPH·是一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基,溶于甲醇、乙醇等極性溶劑中,在517nm處有最大吸收,當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí), DPPH·的單電子由于被配對(duì),會(huì)發(fā)生脫色反應(yīng),因此可用吸光度的變化并以 Trolox等作為對(duì)照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。本研究利用該法來比較楊梅葉、枝、樹皮提取物對(duì)DPPH·清除能力,以蘆丁作為陽性對(duì)照來評(píng)價(jià)其抗氧化能力,結(jié)果如圖 1、表1所示。

圖 1顯示,在低濃度范圍內(nèi),隨著試樣濃度的增大,自由基的清除率呈線性增長(zhǎng),當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí),自由基的清除率趨于平緩。提取物中清除 DPPH·的能力為枝最強(qiáng),其半抑制濃度達(dá) 1907.5±6.40mg TEAC/g,其次是葉和皮,都明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照蘆丁,這說明楊梅葉、枝和樹皮乙酸乙酯萃取物都有較強(qiáng)的清除DPPH·能力。DPPH·有一定選擇性,它不和B-環(huán)上無羥基的黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),也不與芳香酸 (aromatic acid)反應(yīng)[9],因此,相對(duì)于楊梅葉和樹皮提取物來說,楊梅枝提取物的 B-環(huán)上無羥基的黃酮類物質(zhì)和芳香酸含量可能相對(duì)較少。

表 1 楊梅葉、枝、樹皮提取物清除DPPH·和ABTS+·的抗氧化能力

圖1 楊梅葉、枝、樹皮提取物和陽性對(duì)照蘆丁清除DPPH·的濃度依賴關(guān)系(n=3)

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS法是使用最廣泛的間接檢測(cè)方法,可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基 ABTS+·,能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中,在 734nm處有最大吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)能與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。在ABTS+·的最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值的變化,并與 Trolox比較從而換算出被測(cè)物質(zhì)總的抗氧化能力。楊梅葉、枝、樹皮提取物清除ABTS+·情況如圖 2、表 1所示。由圖 2可見,隨著試樣和陽性對(duì)照濃度的增加,其 ABTS+·清除率呈穩(wěn)步增大,當(dāng)試樣濃度達(dá)到一定濃度時(shí),ABTS+·清除率呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)。由表 1可看出,楊梅葉、枝和樹皮提取物清除ABTS+·能力顯著強(qiáng)于陽性對(duì)照蘆丁,其中以楊梅葉最強(qiáng),為 1692.90±31.81mg TEAC/g,其次是枝,皮最弱。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10],天然植物提取物清除 ABTS+·能力與其總酚含量呈正相關(guān),楊梅葉、枝與樹皮提取物清除ABTS+·能力存在顯著差異,這種差異可能就是由其總酚含量差異所致。

圖2 楊梅葉、枝、樹皮提取物和陽性對(duì)照蘆丁清除ABTS+·的濃度依賴關(guān)系(n=3)

2.3 楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗油脂氧化能力

取一定量山茶油,分別加入油樣量的 0.02%、 0.03%、0.04%、0.05%的楊梅葉、枝和樹皮提取物,置于 Ranc imat743儀中,通過電導(dǎo)率的變化來確定誘導(dǎo)時(shí)間的長(zhǎng)短。楊梅葉、枝和樹皮提取物及陽性對(duì)照TBHQ、VE對(duì)山茶油抗氧化作用測(cè)定結(jié)果如表 2所示,其中各種抗氧化劑的抗氧化能力用保護(hù)系數(shù) Pf表示,Pf=I p樣品 /I p空白。

表 2 120℃時(shí)不同添加量的楊梅葉、枝、樹皮提取物對(duì)山茶油的保護(hù)系數(shù) Pf

由表 2可知,楊梅葉、枝、樹皮提取物加入到山茶油都能明顯延長(zhǎng)山茶油誘導(dǎo)時(shí)間,而且隨著添加量增加,其誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng),這表明提取物添加劑量與其抗氧化活性之間存在量效關(guān)系。當(dāng)添加量在0.03%以上,其 Pf都大于 2,表明楊梅葉、枝、樹皮提取物對(duì)山茶油具有很好的抗氧化能力。當(dāng)添加量為0.02%時(shí),各物質(zhì)對(duì)山茶油的抗氧化能力表現(xiàn)為TBHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。

2.4 總抗氧化能力測(cè)定

評(píng)價(jià)提取物總抗氧化能力的方法因其作用機(jī)理的差異可分為直接法和間接法。直接法是研究含有抗氧化物質(zhì)的樣品對(duì)整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)的氧化降解性,氧化的對(duì)象可能為單一脂類、脂混合物、蛋白質(zhì)、DNA或者是含脂的混合物,如血漿、低密度脂蛋白和生物膜等[10]。直接法研究抗氧化物質(zhì)在自由基的引發(fā)、傳遞、清除等過程中所起的作用,在理論上更為充分。因此為了更好更全面評(píng)價(jià)楊梅葉、枝和樹皮提取物抗氧化能力,采用血體系液總抗氧化能力來評(píng)價(jià)。該種方法實(shí)質(zhì)是測(cè)試樣品在生物體系中的還原能力,實(shí)驗(yàn)以VC作為陽性對(duì)照,結(jié)果如表 3所示。抗氧化能力從強(qiáng)到弱的排序依次為VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

表 3 楊梅葉、枝、樹皮提取物總抗氧化能力

3 結(jié)論

采用DPPH·和ABTS+·清除法研究楊梅葉、枝和樹皮提取物的抗氧化能力,是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏可行的方法。楊梅葉、枝和樹皮提取物具有較好的清除DPPH·和ABTS+·的作用,明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照蘆丁,且隨著化合物濃度的增加,對(duì) DPPH·和ABTS+·的清除作用逐漸增強(qiáng),表明提取物劑量與清除自由基的能力間存在量效關(guān)系。其中以楊梅枝提取物清除DPPH·能力最強(qiáng),葉次之,皮最弱;楊梅葉提取物清除ABTS+·能力最強(qiáng),枝次之,皮最弱。

楊梅葉、枝和樹皮提取物在山茶油中均有較強(qiáng)的抗氧化活性,在一定添加劑量范圍內(nèi),其抗氧化活性與添加量存在量效關(guān)系,且 0.05%提取物的效果優(yōu)于0.02%TBHQ;在0.02%添加劑量下,各種提取物對(duì)山茶油的抗氧化能力表現(xiàn)為 T BHQ＞皮提取物 ＞葉提取物 ＞枝提取物 ＞VE。在全血體系下的抗氧化評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)芨诱鎸?shí)反映提取物的抗氧化能力,結(jié)果顯示其抗氧化能力從強(qiáng)到弱的排序依次為 VC＞枝提取物 ＞葉提取物 ＞皮提取物。

本研究結(jié)果表明,楊梅葉、枝和樹皮提取物含有較好的清除自由基,抗山茶油氧化及全血抗氧化能力,是一種極有潛力的天然抗氧化劑資源,其在食品、化妝品及藥品方面的研究將成為今后的工作重點(diǎn)。

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Study on antioxidant activity ofMyrica Rubra leaves, branches and barks extract

FU Yan-ling,ZHANG Y ing,W U Xiao-qin＊
(College ofBiosystem Engineering and Food Science,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China)

2,2-D ip henyl-1-p ic rylhyd razyl(DPPH),2,2′-Azino-b is-(3-ehylbenzothiazoline-6-sulfonic ac id (ABTS),Ranc im a t and tota l antioxidant ab ility in b lood assays we re used to ana lyze the antioxidant ab ility of M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t.It showed tha t,M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t showed s tronge r ab ility to scavenge free red ica ls when comp a ring to the control samp le.Am ong them,w ith the abundance of1907.5±6.40m g TEAC/g,the b ranches extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge DPPH·, then followed by leaves and ba rks,while w ith the abundance of1692.90±31.81m g TEAC/g,the leaves extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge ABTS+·,followed by b ranches and ba rks.It was a dosage-dep endent effec t be tween the antioxidant cap ab ility to cam e llia oil and the add ing am ount,w ith the add ing am ount of0.02%, the antioxidant ab ility to cam e llia oil of extrac ts was as follows：TBHQ ＞ba rks extrac t＞leaves extrac t＞b ranches extrac t＞VE,and the tota l antioxidant comp e tence in the b lood cond ition was as follows：VC＞b ranches extrac t＞leaves extrac t＞ba rks extrac t.

antioxidant ab ility;DPPH·;ABTS+·;cam e llia oil

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0196-04

楊梅 (M yrica rubaSieb.et Zucc)系楊梅科楊梅屬植物,它的果實(shí)、葉和樹皮含有豐富的多酚類物質(zhì)。楊梅葉中含多種酚類化合物,主要由黃酮類化合物及花色素類化合物組成,這兩類化合物均有顯著的生理活性[1]。楊梅樹皮可分離出楊梅素、槲皮素及槲皮素-o-α-L-鼠李糖苷等黃酮類化合物[2],且味苦、性溫,具有散瘀止血、止痛之功效,民間用于治療跌打損傷、骨折、痢疾、胃和十二指腸潰瘍、牙痛等[3]。人體內(nèi)的氧化和抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)這種平衡被打破就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激。人體能通過自身的調(diào)節(jié)耐受輕度的氧化應(yīng)激,但嚴(yán)重的氧化應(yīng)激則需要補(bǔ)充抗氧化劑來補(bǔ)救。許多現(xiàn)代文明病與人體缺乏抗氧化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān),而補(bǔ)充抗氧化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)則有助于對(duì)這些疾病的預(yù)防治療,因此尋找天然、安全、有效的抗氧化劑資源就顯得尤為重要。本文采用熱回流法提取楊梅葉、枝和樹皮中的有效成分,通過清除自由基,對(duì)油脂的抗氧化及全血體系抗氧化等方法對(duì)提取物抗氧化作用進(jìn)行研究,以期為綜合開發(fā)利用楊梅非果部位資源提供一定的參考。

2009-04-03 ＊通訊聯(lián)系人

傅燕玲(1984-),女,碩士研究生,研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。