海金沙黃酮體外抗氧化活性研究

王桃云,陳 娟,彭志任,吳 瓊,陳 鵬

(1.蘇州科技學(xué)院,江蘇蘇州 215009;2.萍鄉(xiāng)市林科所,江西萍鄉(xiāng) 337000; 3.湘東區(qū)林業(yè)局,江西萍鄉(xiāng) 337016;4.揚(yáng)州大學(xué),江蘇揚(yáng)州 225001)

海金沙黃酮體外抗氧化活性研究

王桃云1,陳 娟2,彭志任3,吳 瓊1,陳 鵬4,＊

(1.蘇州科技學(xué)院,江蘇蘇州 215009;2.萍鄉(xiāng)市林科所,江西萍鄉(xiāng) 337000; 3.湘東區(qū)林業(yè)局,江西萍鄉(xiāng) 337016;4.揚(yáng)州大學(xué),江蘇揚(yáng)州 225001)

目的：研究海金沙黃酮(Flavones fromLygodium japonicum,FLJ)的制備與體外抗氧化活性。方法：通過(guò)回流法萃取和大孔吸附樹(shù)脂純化,得到純化的 FLJ。以VC、BHT、蘆丁和槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、烷基自由基的清除率以及抑制油脂過(guò)氧化的能力進(jìn)行研究。結(jié)果：FLJ對(duì)上述自由基均有一定的清除作用,對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力弱于VC、蘆丁和槲皮素;對(duì)油脂抗氧化作用強(qiáng)于 BHT和 VC。濃度為 1.04mg/mL的 FLJ和VC對(duì)烷基自由基的清除能力相當(dāng)。FLJ的添加量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與其抗氧化活性呈正相關(guān)。結(jié)論：FLJ具有明顯的體外抗氧化活性。

海金沙,黃酮,抗氧化活性,清除自由基,體外

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蘆丁、槲皮素、亞油酸 Sigma公司,色譜純;三氯化鋁、鄰苯三酚、甲醇、乙醇、水楊酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氯仿、乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、VC、BHT、FeSO4等 均為國(guó)產(chǎn)分析純;豬油 市售,肥豬板油煎制;海金沙 10月中旬采自蘇州市上方山森林公園。

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;RE52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮玻璃儀器廠;101-1-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)學(xué)器械廠;FA2004N型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;GL-12B型臺(tái)式離心機(jī) 上海飛鴿離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FLJ樣品液的制備 將海金沙洗凈,烘干,粉碎后過(guò) 100目篩,粉末于烘箱中干燥至恒重,稱取10.00g海金沙干粉,加入 200mL 75%乙醇,85℃下恒溫回流提取 4h,提取液在 5000r/min下離心 20min,得上清液,重復(fù)提取兩次,將兩次離心上清液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的 1/4;加入等體積的石油醚,在分液漏斗中分層,棄上相,取下相。將下相液倒入燒杯中,用保鮮膜封口,于 4℃下靜置 24h后,在5000r/min下離心 20min,得上清液,將上清液濃縮至原體積的 1/5,待用。

1.2.2 樣液中 FLJ的純化 選用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)所得 FLJ溶液進(jìn)行純化,稱取適量樹(shù)脂,預(yù)處理后。以 70%乙醇裝層析柱、平衡,用去離子水洗脫后,調(diào) pH至 6.0。緩慢上樣,用 3～4倍體積的去離子水洗去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。依次用 50%、60%、70%、80%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,每次更換乙醇濃度前應(yīng)檢驗(yàn)終點(diǎn)。收集所有含 FLJ的洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所需的濃度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取在 120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品 0.2193g,置于 100mL的容量瓶中,加 10%的甲醇 70mL,置于水浴上微熱至溶解,放冷,加 10%的甲醇稀釋至刻度,搖勻。精確吸取10.0mL,置于 100mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。

精密吸取已制備的對(duì)照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置于 25mL容量瓶中,各加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亞硝酸鈉 0.7mL,混勻,靜置 5min,加 10%硝酸鋁 0.7mL,混勻,靜置 6min,加 1mol/L NaOH 5mL,再加30%乙醇至刻度,混勻,靜置 10min,用紫外分光光度計(jì)在 510nm處測(cè)定吸光度,繪制濃度 Y與吸光度X的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 FLJ最佳吸收波長(zhǎng)的確定 精密量取已制備的對(duì)照品溶液 1.0mL,置于 25mL容量瓶中,加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亞硝酸鈉 0.7mL,混勻,靜置5min,加 10%硝酸鋁 0.7mL,混勻,靜置 6min,加1mol/L NaOH 5mL,再加 30%乙醇至刻度,搖勻,靜置 10min,用紫外分光光度計(jì)在 200～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得掃描圖。

1.2.5 FLJ對(duì)羥基自由基(·OH)清除率的測(cè)定[1]利用 H2O2對(duì) Fe2+混合產(chǎn)生·OH,在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在 510nm下有最大吸收。各試管中分別加入不同濃度的 FLJ溶液 2mL,9mmol/L水楊酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,最后加入 8.8mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng)0.5h,以蒸餾水為空白對(duì)照,在 510nm下測(cè)量各待測(cè)液的吸光度?？紤]到本身的吸光值,以 9mmol/L水楊酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,不同濃度的FLJ溶液 2mL為黃酮的本底吸收。清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度;Ax為加入黃酮溶液后的吸光度;Ax0為不加黃酮溶液本底的吸光度。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度;A1為加入黃酮溶液后的吸光度。

1.2.7 FLJ對(duì)烷基自由基清除率的測(cè)定[3-4]取2.5mL 95%乙醇、2.5mL 0.1mol/L pH8磷酸緩沖液、0.05mL亞油酸和 0.5mL FLJ樣品液,充分混合,用10W紫外燈照射 60min,然后加入 2mL三氯乙酸(20%)和 0.5mL硫代巴比妥酸 (3%,W/V),95℃水浴反應(yīng) 90min,冰浴冷卻,5000r/min離心 20min,于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以等體積雙脫氧水代替 FLJ樣品液,以同濃度的蘆丁和 VC作為對(duì)照。烷基自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0為空白組吸光度;Ai為加樣品液組的吸光度。

1.2.8 FLJ抑制油脂氧化效果測(cè)定[5-6]稱取已測(cè)定POV的豬油 4份,每份 40.0g置于 250mL的錐形瓶中,第 1份加入 6mL乙醇作為空白對(duì)照,第 2份加入6mL 0.5mg/mL VC,第 3份加入 6mL 0.5mg/mL BHT,第 4份加入6mL 0.5mg/mL FLJ,充分振搖后,置 65℃恒溫干燥箱中,每隔 24h取 2.0g油樣測(cè)定 POV值。每次取樣后充分振搖錐形瓶,以混入足夠的空氣。油脂過(guò)氧化值 (POV)測(cè)定方法：按照 GB/T5538-1995的方法測(cè)定。

稱取試樣 2.0g,加入到 250mL錐形瓶中。在裝有試樣的錐形瓶中加入 10mL氯仿溶解試樣,加入15mL乙酸和 1mL碘化鉀飽和溶液,迅速蓋好瓶塞,混勻溶液1min,在 25℃避光靜置 5min。加入約75mL蒸餾水,以 0.5%淀粉溶液為指示劑,用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的碘,滴定過(guò)程要用力振搖。過(guò)氧化值計(jì)算公式為：

式中：V1是用于測(cè)定的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V2是用于測(cè)定豬油的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;C是硫代硫酸鈉標(biāo)定濃度,mol/L;M是試樣的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按 1.2.3所述方法,得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖 2可得回歸方程為：Y=10.148x+0.0069, R2=0.9998,該標(biāo)準(zhǔn)曲線在 0.022～0.11mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 FLJ最佳吸收波長(zhǎng)的確定

由 1.2.4所述方法對(duì) FLJ進(jìn)行測(cè)定,所得光譜掃描結(jié)果如圖 2所示。

圖2 海金沙黃酮吸收光譜圖

由圖 2可知,在 200～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),FLJ的吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為 355nm,此波長(zhǎng)即為 FLJ的最佳吸收波長(zhǎng)。

2.3 FLJ對(duì)·OH的清除率

按1.2.5所述方法,得不同濃度下 FLJ、VC和槲皮素對(duì)·OH的清除率,如圖 3所示。

圖3 FLJ、VC、槲皮素對(duì)·OH的清除率

從圖 3可知,隨著三種物質(zhì)在反應(yīng)液中濃度的增加,對(duì)·OH的清除率呈上升趨勢(shì),當(dāng) VC濃度為0.11mg/mL時(shí),其·OH清除率趨近于 100%,此時(shí)FLJ和槲皮素的·OH清除率分別是 10%和 22%,因此,FLJ對(duì)·OH具有一定的清除力,但作用效果比VC和槲皮素差。

按1.2.6所述方法,得不同濃度下 FLJ、VC和蘆丁對(duì)的清除率,如圖 4所示。

圖 4 FLJ、蘆丁、VC對(duì)·的清除率

由圖 4可知,FLJ、VC和蘆丁對(duì)·均有不同程度的清除作用,而且這三種抗氧化劑對(duì)·的清除作用與其濃度呈量效關(guān)系,清除率隨著其濃度的提高而增大。當(dāng)抗氧化劑濃度為 1.04mg/mL時(shí),FLJ、蘆丁和VC對(duì)·的清除率分別為：59.5%、82.6%和98.8%,蘆丁和VC的清除作用都強(qiáng)于 FLJ。同時(shí),隨著濃度的增大,FLJ對(duì)·清除作用的增長(zhǎng)趨勢(shì)比蘆丁和 VC強(qiáng)。因此,FLJ對(duì)·具有較好的清除作用。

2.5 FLJ對(duì)烷基自由基的清除率

按 1.2.7所述方法,分別對(duì)不同質(zhì)量濃度的 FLJ、VC和蘆丁對(duì)亞油酸氧化體系的抑制能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 5所示。

圖 5 FLJ、蘆丁、VC對(duì)烷基自由基的清除率

從圖 5可知,FLJ、蘆丁和VC對(duì)烷基自由基引發(fā)的亞油酸氧化體系均有不同程度的抑制作用,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),三種抗氧化劑在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)烷基自由基的清除率隨各自濃度的提高而增大,且在不同濃度范圍內(nèi),清除率有顯著差異。當(dāng)三種抗氧化劑的濃度達(dá)到 1.04mg/mL時(shí),FLJ、蘆丁和VC對(duì)烷基自由基的清除率分別達(dá)到 57.01%、67.72%和58.84%,FLJ與蘆丁和VC對(duì)烷基自由基的清除效果相當(dāng)。因此,FLJ對(duì)烷基自由基具有較好的清除作用。

2.6 FLJ抑制油脂氧化效果

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基,自由基與空氣中的氧反應(yīng)生成自由基和過(guò)氧化物,可以用油脂的 POV值來(lái)評(píng)價(jià)其氧化程度,POV值越小,則油脂被氧化的程度越小。按 1.2.8所述方法,得不同濃度下VC、BHT和 FLJ抑制油脂氧化效果,結(jié)果如圖6所示。

由圖 6可知,空白樣在沒(méi)加抗氧化劑時(shí),油脂的POV隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高。加入抗氧化劑 FLJ、VC和BHT后,油脂的 POV在 7d后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加程度明顯比空白要低,且經(jīng) FLJ處理的油脂的POV值明顯比BHT和VC處理的油脂 POV值低。因此,FLJ對(duì)抑制油脂氧化具有良好的效果。

圖6 FLJ、VC、BHT對(duì)油脂氧化的抑制作用

3 結(jié)論

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FLJ有一定的的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基作用;具有較強(qiáng)的清除烷基自由基以及抑制油脂過(guò)氧化的能力;FLJ作為抗氧化功能因子在保健功能食品中的應(yīng)用前景廣闊。

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Study on antioxidant activity of flavones from Lygodium japonicum in vitro

WANG Tao-yun1,CHEN Juan2,PENG Zhi-ren3,W U Qiong1,CHEN Peng4,＊
(1.Suzhou Science and TechnologyUniversity,Suzhou 215009,China; 2.The Forestry Research Institute of Pingxiang,Pingxiang 337000,China; 3.ForestryBureau of Xiangdong County,Pingxiang 337016,China; 4.Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)

O b jec tive：To s tudy the antioxidant ac tivities of FLJ in vitro.M e thods：The FLJ was extrac ted by m e thod of reflux extrac tion and p urified by m ac rop orous adsorp tion res in.The scaveng ing cap ac ities on hyd roxyl free rad ica l, sup e roxide anion rad ica l and a lkyl rad ica l as we ll as inhib ition of POV va lue of the FLJ we re de tec ted while the VC, BHT,que rce tin and rutin flavonoids we re used as p os itive control.Results：The FLJ had som e scaveng ing ab ility on a ll rad ica l had been s tud ied in this exp e r im ent.The scaveng ing ac tivity on hyd roxyl free rad ica l,sup e roxide anion rad ica lwas weake r than VC,que rce tin and rutin flavonoids.W hen the concentra tion was1.04m g/mL the FLJ and VChad equiva lent effec ts on the a lkyl rad ica l.But the FLJ had s tronge r antioxidant ac tivities on inhib ition of POV va lue than BHT and VC.The am ount of FLJ used was in d irec t p rop ortion to the antioxida tion.Conc lus ion：The FLJ had rem a rkab le in vitro antioxidant ac tivity.

Lygod ium jap onicum;flavones;antioxidant ac tivity;scaveng ing cap ac ity to rad ica l;in vitro

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0193-04

海金沙 (Lygodium japonicum)系海金沙科(Lygodiaceae)多年生蕨類植物,海金沙草是海金沙植物的地上部分。資料報(bào)道,海金沙中含有黃酮類化合物,而黃酮類化合物是人體所必需的營(yíng)養(yǎng)素之一,但人體自身不能合成,只能從食物中攝取,黃酮類化合物具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、抗衰老抗心律失常、降血糖、降血脂等功效。近年來(lái),研究自由基及其抑制劑、清除劑和動(dòng)力學(xué)機(jī)制逐漸成為生物及醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)新方向,越來(lái)越受到人們關(guān)注,并取得了一定的研究成果。本實(shí)驗(yàn)利用回流法萃取的海金沙黃酮,對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究,旨在為海金沙綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2009-06-01 ＊通訊聯(lián)系人

王桃云 (1973-),男,講師,在讀博士研究生,研究方向：生物化學(xué)技術(shù)與天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。