咸味香精中美拉德反應產(chǎn)物的抗氧化性研究

于汐洋,汪何雅,＊,錢 和

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

咸味香精中美拉德反應產(chǎn)物的抗氧化性研究

于汐洋1,汪何雅1,＊,錢 和2,＊

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

利用膜分離手段從肉味香基中分離得到不同分子量范圍的美拉德反應產(chǎn)物(MRPs),考察咸味香精中的肉味香基以及不同分子量的MRPs對卵磷脂脂質體的抗氧化效果。結果表明,肉味香基對脂質體過氧化有抑制能力,其抗氧化能力隨反應物濃度的增加而增強。高分子量MRPs的抗氧化能力最強,其次為中分子量MRPs,小分子量MRPs抗氧化能力最弱,并且MRPs的抗氧化能力與其褐色程度成正比。

美拉德反應產(chǎn)物(MRPs),卵磷脂脂質體(LPS),抗氧化,褐色程度

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉味香基 國內某香精公司;透析袋(MWCO 8000～14000) 國藥集團化學試劑有限公司;超濾膜片(MWCO 1000) 無錫賽普膜科技有限公司;大豆卵磷脂、2,2′-鹽酸脒基丙烷 (AAPH) sigma公司,純度 98%;硫代巴比妥酸 (TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸 (VC) 國藥集團化學試劑有限公司,化學純。

UF201超濾設備 無錫賽普膜科技有限公司; R-501旋轉蒸發(fā)器 上海申順生物科技有限公司; YD-900L超聲波細胞粉碎機 上海之信儀器有限公司;THZ-82恒溫水浴振蕩器 常州國華電器有限公司;WFJ7200可見分光光度計 尤尼柯 (上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉味香基中美拉德反應產(chǎn)物的初步分離 稱取肉味香基原樣,稀釋、抽濾得澄清液體。4℃去離子水透析,直到透出液呈無色透明。未透出液記為H-MRPs(＞14kDa),冷凍干燥備用。濃縮透出液,利用截留分子量 1kDa的超濾膜進行超濾分離(使用壓力 0.5MPa),收集滯留液及濾液,分別記為M-MRPs(1～14kDa)、L-MRPs(＜1kDa),冷凍干燥備用。

1.2.2 美拉德反應產(chǎn)物對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

1.2.2.1 大豆卵磷脂脂質體 (LPS)的制備 參照文獻[5]并稍加改進。大豆卵磷脂溶解于石油醚中,通過旋轉蒸發(fā)器(35r/min,水浴 35℃)和氮氣去除有機溶劑,得到均勻分散的卵磷脂薄膜,加入 10mmol/L磷酸緩沖液 PBS(pH 7.4),超聲波處理 15min,得到白色、乳狀的脂質體溶液LPS。

1.2.2.2 美拉德反應產(chǎn)物對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

a.AAPH誘導氧化 首先確定AAPH誘導脂質體氧化最佳反應條件：卵磷脂脂質體濃度、AAPH濃度、反應時間,然后在最佳反應條件下測定樣品對AAPH誘導的卵磷脂脂質體氧化水平的影響。在試管中加入不同濃度的LPS、AAPH和樣品,混勻,避光于 37℃水浴孵育一定時間,冷卻,加入 2mL TCATBA-HCl,混合液于沸水浴加熱 15min,迅速冷卻, 5500r/min離心 20min,取上清液于 532nm測定得到吸光度 As,重蒸水為空白對照,測得吸光度 Ac[6]。TBARS產(chǎn)物在 532nm的摩爾吸收系數(shù)為 1.56× 105M-1·cm-1。按下式計算樣品對脂質體過氧化的抑制率：

b.Fe3+/VC誘導氧化[7]試管中依次加入 1mL LPS、1mL 400μmol/L FeCl3、1mL 400μmol/L VC和1mL樣品,混勻。避光并于 37℃水浴加熱 60min,脂質過氧化測定及抑制率的計算方法同上。

c.自動氧化 試管中加入LPS,避光并于 37℃水浴加熱 24h,脂質過氧化測定及抑制率的計算方法同上。

1.2.3 美拉德反應產(chǎn)物褐色程度的測定 用可見分光光度計在 420nm處測定。

2 結果與討論

2.1 AAPH誘導的卵磷脂脂質體氧化條件的確定

不同脂質體濃度、AAPH濃度和反應時間對脂質體氧化的影響見圖 1～圖 3。

圖1 不同濃度脂質體的氧化作用(反應 1h,AAPH為 5mmol/L)

圖2 不同濃度AAPH對脂質體的氧化作用(反應 1h,脂質體為 10mg/mL)

圖 3 不同反應時間對脂質體的氧化作用(脂質體為 10mg/mL,AAPH為 5mmol/L)

由圖 1可見,當脂質體濃度為 10mg/mL時,其氧化所生成的 TBARS量為最大,而濃度為 15mg/mL的脂質體,由于其本身在 532nm有較大吸收,且乳狀液靜置有沉淀,故最佳卵磷脂脂質體濃度為 10mg/mL。由圖 2可見,AAPH濃度在 1～5mmol/L之間 T BARS量的變化有波動,且 10mmol/L AAPH引發(fā)脂質體氧化所生成的 T BARS量相比較 5mmol/L差異不顯著(P＞0.05),故最佳 AAPH濃度為 5mmol/L。由圖 3可見,反應 1h后脂質體氧化程度最大,繼續(xù)反應脂質體的氧化反而受到抑制,且存在顯著差異(P＜0.05),故最佳反應時間為 1h。

綜上所述,AAPH誘導卵磷脂脂質體氧化的最佳反應條件為：卵磷脂脂質體濃度為 10mg/mL,AAPH濃度為 5mmol/L,反應時間為 1h。

2.2 肉味香基對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

肉味香基原樣對三種脂質體氧化體系的影響見圖 4。由圖 4可見,肉味香基原樣對三種脂質體氧化體系都表現(xiàn)了較好的抑制能力,隨著肉味香基濃度的增大,其對脂質體過氧化的抑制作用增強。很多研究表明,美拉德反應產(chǎn)物中有一定抗氧化活性的物質主要是類黑精、還原酮及一些含 N、S的雜環(huán)化合物。類黑精是美拉德反應中的大分子聚合體,由于其短肽氨基酸序列可促進肽與脂肪酸的相互作用,提高其對脂質自由基的捕捉能力,因而具有抗氧化活性[7];還原酮具有還原和螯合作用,這對抗氧化能力有一定的貢獻;同時,美拉德反應產(chǎn)生的揮發(fā)性雜環(huán)化合物,如吡咯、呋喃、噻吩等,有助于自由基的親電加成,因而具有較好的抗氧化能力[8]。同時,由圖 4發(fā)現(xiàn),相同濃度的肉味香基對三種脂質體氧化體系的抑制效果有一定差異,肉味香基對 Fe3+/VC誘導的脂質體氧化的抑制率最強。有學者指出[9],在使用過渡金屬的氧化還原反應引發(fā)氧化時,體系中的一些成分(如 VC)能與自由基反應,干擾測定結果;同時MRPs不僅能清除自由基,還可螯合金屬離子,因此其對 Fe3+/VC誘導的脂質體氧化的抑制作用比對自由基誘導的脂質體氧化要強。

圖 4 肉味香基原樣對三種脂質體氧化體系的影響

2.3 不同分子量范圍的MRPs對卵磷脂脂質體氧化水平的影響

2.3.1 MRPs對AAPH誘導的卵磷脂脂質體氧化水平的影響 圖 5描述了不同分子量范圍的MRPs對AAPH誘導的卵磷脂脂質體氧化水平的影響。由圖可見,初步分離后不同分子量范圍的MRPs產(chǎn)物對脂質體表現(xiàn)出抗氧化能力,但是它們的抑制效果有明顯差異。反應物起始濃度為 5mg/mL時,H-MRPs (分子量 ＞14kDa)與M-MRPs(分子量 1～14kDa)顯著抑制了AAPH誘導的卵磷脂脂質體氧化,抑制率分別為 74.38%和 24.79%,但 L-MRPs(分子量 ＜1kDa)沒有抑制效果。當反應物起始濃度增為10mg/mL時,L-MRPs的抑制率為 33.44%,而M-MRPs以及 H-MRP對脂質體氧化的抑制率則分別達到了 69.84%和 97.38%,抑制效果非常明顯。綜上可得,在AAPH引發(fā)的脂質體氧化體系中,不同分子量MRPs產(chǎn)物的抗氧化活性大小為：H-MRPs＞M-MRPs＞L-MRPs,其中 L-MRPs在低濃度不表現(xiàn)出抗氧化能力。

圖5 不同分子量范圍的MRPs對AAPH誘導的脂質體過氧化的抑制作用注：＊與陰性對照相比較 P＜0.05,圖 6、圖 7同。

2.3.2 MRPs對 Fe3+/VC誘導的卵磷脂脂質體氧化水平的影響 圖 6描述了不同分子量范圍的MRPs對Fe3+/VC誘導的卵磷脂脂質體氧化水平的影響。由圖可見,樣品濃度為 5mg/mL時,L-MRPs對脂質體氧化基本無影響,M-MRPs和H-MRPs的抗氧化抑制率分別為 46.02%和 75.68%;當濃度增至 10mg/mL后,各分離產(chǎn)物的抗氧化能力明顯提高。綜上可得,在 Fe3+/VC引發(fā)的卵磷脂脂質體氧化體系中,不同分子量MRPs產(chǎn)物的抗氧化活性大小為：H-MRPs＞M-MRPs＞L-MRPs,其中 L-MRPs在低濃度時對脂質體氧化無影響。

圖 6 不同分子量范圍MRPs對 Fe3+/VC誘導的脂質體過氧化的抑制作用

2.3.3 MRPs對卵磷脂脂質體自動氧化水平的影響 圖7顯示了不同分子量范圍的MRPs對卵磷脂脂質體自動氧化的影響。由圖 6可見,各MRPs對卵磷脂脂質體抗氧化效果與前兩種誘導方式所得到的結果相似,不同分子量MRPs產(chǎn)物的抗氧化活性由大到小為：H-MRPs＞M-MRPs＞L-MRPs,其中L-MRPs在低濃度時對脂質體氧化無影響。

圖7 不同分子量的MRPs對脂質體自動氧化的抑制作用

結合三種脂質體氧化體系,測定結果顯示,不同分子量范圍的MRPs產(chǎn)物對脂質體過氧化均能起到抑制效果,隨著反應濃度的增加,其抗氧化能力增大。三種脂質體氧化體系中,不同分子量范圍的MRPs抗氧化活性由大到小均為：H-MRPs＞M-MRPs＞L-MRPs。由此可見,美拉德反應產(chǎn)物的抗氧化作用主要來自于大分子量物質類黑精。Pellegrini等[10]測定可溶性類黑精的抗氧化能力時發(fā)現(xiàn)其具有很強的抗氧化性,大分子量的類黑精能夠抑制還原型輔酶Ⅱ和谷胱甘肽-S-轉移酶的活性。Castillo[11]等從面包中分離得到類黑精,相比較低分子量化合物,類黑精具有更強的清除過氧化自由基的能力。本實驗中,雖然 L-MRPs的抗氧化能力最弱,但其在較高濃度下也表現(xiàn)出較好的抗氧化效果,這可能來源于原始反應物,如還原糖類和二羥基丙酮具有強的還原性,而組氨酸、賴氨酸和色氨酸也具有還原能力,同時低分子量的類黑精也具有較強的抗氧化能力[12]。類黑精的抗氧化機理主要表現(xiàn)為捕獲親電子基團、清除氧自由基和螯合金屬離子的能力[13]。

2.4 MRPs抗氧化能力與褐色程度的關系

圖 8描述了肉味香基及初步分離后的各MRPs產(chǎn)物的抗氧化能力與其褐色程度之間的關系。由圖可見,相同濃度下,各MRPs的抗氧化能力與顏色有一定的正相關性,H-MRPs的吸光度最高,其抗氧化能力也最強。H-MRPs的高吸光度主要是褐色聚合體——類黑精的作用,它是一種以短肽和色素相結合的混合體。許多研究表明,美拉德反應物的抗氧化能力與其顏色存在一定的關系。Lingnert等人[14]指出,MRPs抗氧化性能與其顏色成正比。Yosh imura[15]等初步研究葡萄糖一甘氨酸的反應產(chǎn)物的抗氧化能力時發(fā)現(xiàn),一部分類黑精抗氧化能力甚至超過BHA和沒食子酸丙酯等,但是如果采用吸附樹脂對其脫色處理,其抗氧化能力則大大下降。

圖8 肉味香基及不同分子量MRPs的抗氧化能力與褐變程度的關系(反應物濃度為 1mg/mL)

3 結論

本研究結果顯示,肉味香基對三種脂質體過氧化體系都表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。通過透析與超濾相結合的方法,從肉味香基中初步分離得到三個不同分子量段的 MRPs(H-MRPs、M-MRPs和L-MRPs),三種MRPs均具有顯著的抗氧化活性,其抗氧化活性從強到弱依次為：H-MRPs＞M-MRPs＞L-MRPs,并且MRPs的抗氧化能力與反應物濃度有較好的正相關性。通過研究不同分子量MRPs產(chǎn)物的褐色強度和抗氧化活性的關系,結果發(fā)現(xiàn),MRPs抗氧化性能與其褐色強度成正比。

美拉德反應是一個復雜的反應體系,雖然本研究顯示,肉味香基和三個不同分子量段的MRPs都具有顯著的體外抗氧化作用,但是體外研究結果并不能完全代表它們的體內功效,對于體內抗氧化作用還需用細胞和動物實驗加以驗證。此外,MRPs產(chǎn)物非常復雜,對于其中是哪些物質或具有哪類分子結構的物質發(fā)揮抗氧化活性尚不清楚,有待進一步的分離純化,探討其結構特性與抗氧化活性之間的關系。

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Antioxidant activities ofMaillard reaction products in savory flavors

YU Xi-yang1,WANG He-ya1,＊,QI AN He2,＊
(1.Food College,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.State Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Three M a illa rd reac tion p roduc ts(MRPs)w ith d iffe rent m olecula r we ights we re p rep a red by m em b rane sep a ra tion from m ea t flavoring.The inhib ition ofm ea t flavoring and the three MRPs w ith d iffe rentm olecula rwe ights aga ins t oxida tion of lec ithin lip osom e sys tem we re inves tiga ted.The results ind ica ted tha t m ea t flavoring inhib ited oxida tion of lec ithin lip osom e sys tem,and its antioxidant cap ac ity inc reased w ith the inc rease of its concentra tion. MRPs w ith highes t m olecula r we ight showed the highes t antioxidant cap ac ity,then MRPs w ith m idd le m olecula r we ight and the lowes twas m olecula rwe ight.The antioxidant cap ac ity ofMRPs was dep endent of its colour index.

M a illa rd reac tion p roduc ts(MRPs);lip osom e(LPS);antioxidant;color

TS264.3

A

1002-0306(2010)03-0181-04

美拉德反應是在食品加工和儲存過程中氨基酸或蛋白質和碳水化合物發(fā)生的一系列復雜反應,它是食品烹調和加工過程中產(chǎn)生食品風味和食品色澤的重要途徑。在面包的烘烤、肉制品的煎炸、咖啡的烘焙等過程中,美拉德反應給食品帶來香氣,賦予了食品特殊的風味。許多研究表明,氨基酸-還原糖模擬體系的反應產(chǎn)物、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的美拉德反應產(chǎn)物 (Maillard reaction products, MRPs)具有抗氧化功能[1-3]。MRPs的抗氧化功能主要來源于有色物類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物,其中的某些物質的抗氧化能力能達到常用抗氧化劑同樣的水平,如在高脂類食品中加入MRPs產(chǎn)物能抑制其脂類氧化[4]。通過氨基酸或植物蛋白水解物與還原糖高溫加熱發(fā)生Maillard反應,制備得到的反應型肉味香基香味逼真,成本低廉,是開發(fā)咸味香精必不可少的配料,廣泛應用于方便面、湯料、肉制品、膨化食品、餅干等加工食品中,以增加或賦予食品肉風味,滿足人們對肉風味的需要。盡管人們針對氨基酸-還原糖模擬體系的反應產(chǎn)物、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的MRPs的抗氧化性展開了大量研究,但針對咸味香精中MRPs的抗氧化功能還未見報道。本研究以咸味香精調配前的肉味香基為對象,利用膜過濾手段從肉味香基中初步分離得到不同分子量范圍的MRPs,考察分離前肉味香基以及分離后MRPs的體外抗氧化效果。同時,探討了各MRPs的褐色程度與抗氧化效果之間的關系。

2009-06-12 ＊通訊聯(lián)系人

于汐洋 (1985-),女,碩士,主要從事食品的功能和安全性研究。