轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)復(fù)合蛋白冷致凝膠性能及對茶堿的控釋研究

王曉園,楊曉泉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)復(fù)合蛋白冷致凝膠性能及對茶堿的控釋研究

王曉園,楊曉泉＊

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG酶)誘導(dǎo)大豆分離蛋白-明膠形成復(fù)合蛋白冷致凝膠并將其用作茶堿的控釋載體,同時對其在模擬胃液和腸液中的控釋特性進行研究。結(jié)合動態(tài)流變測試盒掃描電鏡技術(shù)研究了復(fù)合冷致凝膠性質(zhì)和表面形態(tài)。結(jié)果表明：大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠呈現(xiàn)致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),制備的冷致凝膠在模擬胃液中均呈現(xiàn)溶脹狀態(tài),在模擬腸液中逐漸被消化,且其在模擬胃液中溶脹率較低。凝膠在模擬胃液(pH1.2)中的釋藥率相對模擬腸液(pH7.4)要快,水凝膠對于茶堿的保護能保持至少 5h,因此,MTG酶誘導(dǎo)的復(fù)合蛋白冷致凝膠對于功能食品的開發(fā)將有深遠影響。

大豆分離蛋白,明膠,茶堿,水凝膠,釋放

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 實驗室自制;明膠 廣州合誠實業(yè)有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 廣州明遠工貿(mào)有限公司;十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 廣東光華化學(xué)廠有限公司。

3202S型 pH計 瑞士Metter Toledo有限公司; DELTA 1-24/LSC冷凍干燥機 德國 Christ公司; JS M-6360LV掃描電鏡 日本電子公司;RHS600哈克流變儀 德國 Hakke公司;UV3200紫外/可見分光光度計 上海美譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白-明膠復(fù)合冷致凝膠的制備取一定質(zhì)量的大豆分離蛋白和明膠,分別溶于一定量pH7.5的磷酸緩沖液中,將兩者按照一定的比例混合,加入或不加一定濃度的茶堿,最后加入定量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián),攪拌均勻,真空抽氣后放入5mL的燒杯中,37℃密封保存 4h。取出凝膠做控釋性能或溶脹性能測定。

1.2.2 大豆分離蛋白-明膠凝膠的微結(jié)構(gòu)形態(tài) 將制備好的凝膠用戊二醛-砷酸緩沖液固定 24h后用二鉀砷酸鈉漂洗 3次,鋨酸固定1.5h。用二鉀砷酸鈉漂洗 3次,30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水,最后用 100%叔丁醇脫水,冷凍干燥。切取干燥后的凝膠表面噴金,用 JS M-6360LV掃描電鏡在15kV加速電壓下觀察其表面形態(tài)。

1.2.3 大豆分離蛋白-明膠凝膠的流變學(xué)性能研究

凝膠性能測定方法：本實驗采用的儀器是哈克流變儀平行板間隙設(shè)置為 1mm,實驗時取 1mL樣品分散液置于平板之間,除去過量的樣品,在樣品裸露部位添加一層薄硅油,以防止水分的蒸發(fā)。記錄彈性模量(G′)隨時間的變化曲線。

1.2.4 凝膠在模擬胃腸液中的溶脹性能研究 將制備好的一系列凝膠,分別置于模擬胃腸液中溶脹,測定溶脹度(SR)。

式中：wt是溶脹 t時間后濕態(tài)凝膠的質(zhì)量 (g); w0是溶脹前凝膠的質(zhì)量 (g)。

1.2.5 茶堿標準曲線的繪制 分別用模擬胃液、模擬腸液作為溶劑,配制濃度分別為 0、1.25、5、10、15、20mg/L的茶堿溶液,在波長 272nm處測定吸光度,繪制吸光度/茶堿質(zhì)量濃度的標準曲線。茶堿在模擬胃液中的標準曲線方程為：Y=0.054X+0.0005, R2=0.9995;茶堿在模擬胃液中的標準曲線方程為：Y=0.064X-0.0032,R2=0.9998。

1.2.6 復(fù)合蛋白冷致凝膠在模擬胃腸液中的釋藥性能研究 茶堿在模擬胃液中的釋放：調(diào)節(jié)電熱恒溫振蕩水槽的溫度為 37±0.5℃,振蕩速度為 150r/min。稱取一定量的載藥凝膠,裝入纖維素透析袋 (分子量7000～10000g·mol-1)中,將袋口扎緊后,置于預(yù)熱好的模擬胃液 (200mL)中釋放 5h,每隔一定時間用移液槍移取一定量的釋放液,以空白胃液作參比,測 A272,加相同體積的溶出介質(zhì)補充到釋放體系中,保持體積恒定在 200mL。根據(jù)釋放體系中茶堿濃度的變化,計算不同時間茶堿從凝膠中的釋放量及累積釋放率。

茶堿在模擬腸液中的釋放：調(diào)節(jié)電熱恒溫振蕩水槽的溫度為 37±0.5℃,振蕩速度為 150r/min。稱取一定量的載藥凝膠,裝入纖維素透析袋 (分子量7000～10000g·mol-1)中,置于預(yù)熱好的模擬腸液(200mL)中釋放 5h,每隔一定時間用移液槍移取一定量的釋放液,以空白腸液作參比,測A272,加相同體積的溶出介質(zhì)補充到釋放體系中,保持體積恒定在200mL。根據(jù)釋放體系中茶堿濃度的變化,計算不同時間茶堿從凝膠中的釋放量及累積釋放率。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠流變學(xué)性質(zhì)的研究

由圖 1可以看出,單一的 2%明膠在 10u/gMTG酶誘導(dǎo)下基本不形成凝膠,其彈性模量 G′在 10Pa以下,將明膠加入大豆分離蛋白用同濃度酶誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),明膠的加入增強了蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)。隨著時間的增長,酶誘導(dǎo)的蛋白復(fù)合冷致凝膠的凝膠強度不斷增強,這是由于MTG酶催化交聯(lián)蛋白是一個隨時間變化的動態(tài)過程,一定的酶促反應(yīng)時間有利于凝膠彈性的提高。

圖1 MTG酶對大豆分離蛋白、明膠及其復(fù)合蛋白冷致凝膠性質(zhì)的影響

由圖 2可知,隨著體系中明膠濃度的增強,復(fù)合蛋白的凝膠性質(zhì)也得到加強。蛋白質(zhì)凝膠的形成機制一般認為是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-溶劑的相互作用以及鄰近肽鏈之間的吸引力和排斥力平衡的結(jié)果。蛋白質(zhì)的凝膠化主要取決于其內(nèi)在結(jié)構(gòu)、分子性質(zhì)、凈電荷和相對分子質(zhì)量[9]。蛋白質(zhì)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要依賴于體系中的相互作用,如氫鍵、疏水鍵和靜電相互作用,二硫鍵的形成與交聯(lián)也可以使分子間的網(wǎng)絡(luò)得到加強。在兩種或多種不同的蛋白質(zhì)體系中,MTG酶催化哪種蛋白質(zhì)先聚合,或者是否以同樣程度使它們聚合,甚至彼此間是否發(fā)生交聯(lián),至今仍未有明確結(jié)論。近來,Eduard[10]研究了MTG酶對于乳清蛋白與明膠間的交聯(lián)作用,其研究表明,在蛋白質(zhì)沒有變性和沒有還原劑的條件下,乳清蛋白與明膠之間沒有發(fā)生交聯(lián)作用。對于MTG酶是否誘導(dǎo)大豆分離蛋白和明膠之間發(fā)生交聯(lián),作者將會在下階段研究工作中探討。

圖 2 明膠的濃度對于大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)的影響注：S-G-0：10%SPI+0%Gelatin;S-G-1：10%SPI+1%Gelatin; S-G-3：10%SPI+3%Gelatin;MTG酶活性是 10u/g。

從圖 3中可以看出,茶堿的加入弱化了復(fù)合蛋白冷致凝膠的凝膠性質(zhì),這可能是由于茶堿是弱酸性藥物,茶堿的加入不但阻礙了MTG酶與蛋白質(zhì)的相互作用,也弱化了MTG酶的活性,從而使得蛋白質(zhì)的凝膠強度減弱。

圖 3 茶堿對于大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠性質(zhì)的影響

2.2 大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠微結(jié)構(gòu)的研究

由大豆分離蛋白-明膠復(fù)合冷致凝膠的微結(jié)構(gòu)圖可以觀察出,隨著明膠濃度的增加,凝膠的空間結(jié)構(gòu)變得致密。單純的 SPI凝膠的結(jié)構(gòu)是多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),但孔徑非常微小,當在 SPI中添加明膠時,凝膠的結(jié)構(gòu)逐漸變得致密,當明膠的添加量達到 3%時,凝膠的結(jié)構(gòu)變的致密而沒有孔徑,這可能是由于明膠的加入填充了大豆分離蛋白的網(wǎng)絡(luò)空間,使其結(jié)構(gòu)變得堅實致密。

圖 4 大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠的 SEM圖

2.3 大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠的溶脹動力學(xué)研究

蛋白質(zhì)冷致凝膠是一種 pH敏感性凝膠,凝膠中含有大量易水解或質(zhì)子化的酸和堿性基團 (如羧基和氨基),可以根據(jù)環(huán)境 pH變化奪取或釋放質(zhì)子,使得水凝膠吸水溶脹或脫水收縮,從而可以有效地調(diào)節(jié)和控制凝膠內(nèi)物質(zhì)的擴散和釋放[11]。由圖 5可以看出,酶誘導(dǎo)的復(fù)合蛋白冷致凝膠在胃液中呈現(xiàn)溶脹的性能,但是溶脹速率較低,5h的時間內(nèi)其溶脹速率只達到 25%(w/w)。隨著體系中明膠濃度增大,復(fù)合蛋白冷致凝膠的溶脹速率變慢,溶脹度降低。這可能是由于體系中蛋白質(zhì)含量較低時,凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)多呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀,凝膠內(nèi)自由空間大,凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對疏松。隨著明膠濃度增加,凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得緊密,網(wǎng)格變小,限制了親水基團與水的相互作用。

圖 5 不同濃度分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠在模擬胃液中的溶脹性能曲線

由圖 6看出,蛋白凝膠在開始的 0.5h前表現(xiàn)出有限的water uptake能力,并且在隨后的 4h質(zhì)量逐漸減少,這是因為大豆分離蛋白中含有攜帶自由羧基的氨基酸[12](如天冬氨酸和谷氨酸)比例較高,其在腸液中電離產(chǎn)生較大的靜電斥力[13],水凝膠內(nèi)部的靜電斥力足夠強以致于可以耐受凝膠在初始 0.5h的溶脹,因此其溶脹速率非常微小,0.5h后即在腸液中逐漸被消化從而發(fā)生崩解?？紤]到蛋白凝膠內(nèi)部較弱和粗糙的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[14],在蛋白凝膠被放入腸液中,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排,這也是其溶脹率在起初 0.5h前很低的原因。蛋白凝膠在胃液環(huán)境中時并沒有存在質(zhì)量的損失,這可能是由于蛋白質(zhì)會在低 pH的條件下沉淀,有助于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并能阻止其被消化降解。

圖 6 不同濃度分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠在模擬腸液中的溶脹性能曲線

2.4 大豆分離蛋白-明膠混合凝膠的體外釋放實驗

復(fù)合蛋白冷致凝膠的釋藥性能與凝膠本身的性質(zhì)、溶脹性能及其藥物的性質(zhì)密切相關(guān)。在凝膠體系中,凝膠內(nèi)部含有的疏水基團由于疏水相互作用而形成若干膠束,這些膠束可以包覆藥物有機小分子,或與藥物的疏水基相結(jié)合。復(fù)合蛋白冷致凝膠中親水基團通過氫鍵與溶液中的水分子作用,也可以與茶堿分子中的親水基團作用。在模擬胃液釋藥過程中,凝膠由表及里發(fā)生溶脹,包裹在擬胃腸液中的茶堿溶解且隨溶劑分子的滲入逐漸向外擴散。隨著溶脹過程的進行,凝膠親水性增強,水分子與凝膠的相互作用增強,導(dǎo)致凝膠的溶脹度增大,茶堿有更多的流通空間。在實驗中發(fā)現(xiàn),凝膠強度較強,結(jié)構(gòu)較致密的凝膠對于茶堿在模擬胃腸液中的釋放相對緩慢,相反,凝膠強度較低,結(jié)構(gòu)較疏松的凝膠對于茶堿的釋放較迅速。不同濃度的大豆蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠的釋藥性能與其溶脹性能及其微觀結(jié)構(gòu)是一致的。復(fù)合蛋白冷致凝膠總體具有較快的釋藥速率,即 5h后基本釋放完全,這與所選模型藥物茶堿的水溶解性較高有關(guān)。盡管如此,復(fù)合蛋白冷致凝膠對茶堿還是具有一定的緩釋效果。

圖 7 不同濃度分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠在模擬胃液中對于茶堿的釋放性能曲線

圖 8 不同濃度分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠在模擬腸液中對于茶堿的釋放性能曲線

3 結(jié)論

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)明膠與大豆分離蛋白制備了一種新型的復(fù)合蛋白冷致凝膠,凝膠在pH1.2的模擬胃液中呈現(xiàn)溶脹狀態(tài),在pH7.4的模擬腸液中逐漸崩解。茶堿在復(fù)合蛋白冷致凝膠中釋放,突釋相約在 1.5h,隨即進入緩釋相,5h后釋放完全。同時,改變蛋白質(zhì)的濃度可以來控制凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度,從而可調(diào)節(jié)凝膠的溶脹性能和釋藥性能,因此大豆分離蛋白-明膠復(fù)合蛋白冷致凝膠可以保護生物活性物質(zhì)在胃腸道中的輸送。

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Transglutam inase cross-linking treatm ents of composite protein cold-set hydrogels as controlled delivery devices for theophylline

WANG Xiao-yuan,YANG Xiao-quan＊
(College ofLight Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China)

C ross-linking of m ic rob ia l transg lutam inase (M TGase)wasapp lied during p roduc tion of p rote in hyd roge ls via incuba tion and hea ting trea tm ent.A lso the controlled re lease of theop hylline from hyd roge ls was inves tiga ted unde r the cond itions of m im ic gas tric and intes tina l fluid.The ge l p rop e rties and the s truc ture of the hyd roge ls we res tud ied com b ined w ith the dynam ic rheolog ica l ana lys isand e lec tron m ic roscop y scanning technique.The results showed tha t s truc ture of the hyd roge ls was dense ne twork and the swe lling ra tio of the hyd roge ls in ac id m ed ium was low,while they we re a ll d iges ted in intes tina l fluid a t pH7.4.Furthe rm ore,the re lease ra tio of the hyd roge ls in the gas tric fluid(pH1.2)was highe r than tha t in intes tina l fluid(pH7.4),a ll hyd roge ls typ es p rovided good p rotec tion of theop hylline for a t leas t5h.They should be of g rea t inte res t to deve lop e rs of innova tive func tiona l foods.

soy p rote in isola te;ge la tine;theop hylline;hyd roge ls;re lease

TS201.1

A

1002-0306(2010)03-0095-04

近年來,控釋輸送體系的研究備關(guān)注,一些藥物和功能性食品成分在加工及消化吸收過程中生物活性的降低非常普遍。目前Ankareddi等[1]將聚 (N-異丙基丙烯酰胺)(PN IPAAm)低聚物接枝到聚甲基丙烯酸羥乙酯合成 P(HE MA-g-N IPAAm)水凝膠,研究其對茶堿和菊粉的控釋性能。Zhang等[2]采用后封裝技術(shù)研究了由 PEO-PPO-PEO嵌段共聚物和低聚乳酸組成的智能、可生物降解水凝膠膜對血紅蛋白、牛血清白蛋白的釋放情況。Lin等[3]合成了N-(2-羧基苯甲基)殼聚糖,并用戊二醛交聯(lián)得 pH敏感水凝膠(CBCSG)用于藥物傳輸。這些研究雖然在方法上有一定的創(chuàng)新,但普遍使用了一些有毒的交聯(lián)劑,如戊二醛等,對人體健康存在潛在危害。本實驗室近年來開展了食物蛋白交聯(lián)聚合改性及其聚集體的研究,詳細研究了該聚合反應(yīng)的條件和機理, Tang[4]等利用MTG酶誘導(dǎo)反應(yīng)研究了冷致豆腐凝膠的形成和性能,姜燕[5]等研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對于大豆分離蛋白成膜性的影響,唐傳核等[6-8]對MTG酶聚合大豆蛋白及其改性機理進行研究。本實驗擬于低溫條件下通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo) (MTG酶凝膠化)控制復(fù)合蛋白冷致凝膠的微結(jié)構(gòu)以構(gòu)建具有不同結(jié)構(gòu)與控釋性能特性的水凝膠,并將其應(yīng)用至功能因子及其藥物的載運。與傳統(tǒng)控釋載體相比,用于運載功能因子及藥物的復(fù)合蛋白水凝膠具有無毒、高效、低成本等特性。目前,國內(nèi)外尚無將復(fù)合蛋白水凝膠應(yīng)用到功能因子和藥物輸送領(lǐng)域的研究,因此,構(gòu)建食源性功能因子輸送體系對現(xiàn)代食品工業(yè),尤其是功能性食品開發(fā)具有重要應(yīng)用價值。

2009-06-30 ＊通訊聯(lián)系人

王曉園 (1984-),女,碩士研究生,研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006BAD27B04)。