Listeria monocytogenes在經(jīng)高氧化還原電位酸性水處理的鮮食萵苣上預(yù)測模型的建立

丁 甜,董慶利,相啟森,吳德渙

(1.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所,上海 200093; 2.國立江原大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)科,韓國春川 200701; 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

Listeria monocytogenes在經(jīng)高氧化還原電位酸性水處理的鮮食萵苣上預(yù)測模型的建立

丁 甜1,2,董慶利1,相啟森3,吳德渙2,＊

(1.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所,上海 200093; 2.國立江原大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)科,韓國春川 200701; 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

采用高氧化還原電位酸性水(EOW)對接種過單核細(xì)胞增生李斯特菌的鮮食萵苣進(jìn)行處理,研究殘留菌在不同溫度下的保存期限。建立 Gompertz,Logistic和Baranyi初級模型,描述單增李斯特菌在不同溫度下的生長情況,對比結(jié)果表明,Gompertz模型的判定系數(shù) R2=0.9913,能夠更好地?cái)M合李斯特菌在各個(gè)溫度下的生長狀況,并得到李斯特菌生長的 Gompertz模型生長參數(shù)(SGR,LT,MPD)。利用平方根模型對其的最大比生長速率的平方根-溫度進(jìn)行擬合,得到萵苣上單核細(xì)胞增生李斯特菌生長的二級模型： SGR=0.015T+0.069。使用判定系數(shù) (R2)、均方誤差(MSE)、偏差因子(BF)和準(zhǔn)確因子(AF)對模型進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,本研究得出的二級模型能夠很好地預(yù)測單核細(xì)胞增生李斯特菌在相應(yīng)環(huán)境下的生長狀況。

單核細(xì)胞增生李斯特菌,高氧化還原電位酸性水,萵苣,預(yù)測模型,驗(yàn)證

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高氧化還原電位酸性水 由電解水生成裝置A2-1000(220V,30A,Korean E&S Fist Inc,Seoul, Korea)電解 0.1%氯化鈉溶液得到。當(dāng)電流設(shè)置到12A時(shí),電位酸性水和電位堿性水同時(shí)分別從陽極和陰極管中流出,當(dāng)觀察到有穩(wěn)定的水流從管中持續(xù)流出時(shí),15min后,從陽極管收集實(shí)驗(yàn)所需的高氧化還原電位酸性水 (氯濃度 50μg/mL;pH＜2.7; ORP：1150～1180mV);萵苣 購于當(dāng)?shù)氐某?GS.Market,Chunchon,Korea),然后立即保存在 4℃的保鮮冰箱中;實(shí)驗(yàn)菌株 L.m onocytogenesScott A、L.m onocytogenesATCC 19116和L.m onocytogenesATCC 19118;中和劑 含 0.5%硫代硫酸鈉的胰蛋白胨生理鹽水溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液準(zhǔn)備 分別取 10μL原種菌液接種到10mL TSBYE(TSB,Difco,Sparks,MD,U.S.A.)培養(yǎng)基中,置于 35℃的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24h,使菌體細(xì)胞濃度大約為 109cfu/mL。然后在 10min,5000×g, 4℃的離心條件下重復(fù)離心 2次,得到的菌體用濃度為 0.1%的蛋白胨緩沖溶液 (Buffered peptone water, Difco,USA)沖洗,得到濃度為 109cfu/mL的李斯特菌混合溶液。將上述菌體細(xì)胞懸液稀釋到107cfu/mL,保存在 4℃的恒溫箱中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 稱取 57.5g牛津培養(yǎng)基 (Oxford medium base),溶于 1000mL純凈水中,連續(xù)緩慢加熱至沸騰,使其充分混合均勻,1min后,在 121℃下滅菌 10min。當(dāng)冷卻至 45～50℃時(shí),加入 10mL rehydrated oxford ant imicrobic supplement,混合均勻后,制備平板。

1.2.3 樣品的制備 把萵苣外層脫色、萎蔫的部分去掉,只取新鮮的葉子并用消毒的手術(shù)刀切成 3cm× 3cm的小片,每次稱取 10g置于無菌的均質(zhì)袋 (Nasco Whirl-Pak,Janesville,W I)中,做好標(biāo)記后保存在 4℃保鮮冰箱中備用(24h以內(nèi))。將濃度為 107cfu/mL的菌懸浮液接種到萵苣樣品上,使樣品的初始菌數(shù)大致為 105cfu/g。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)操作 將接種后的萵苣樣品在常溫下用高氧化還原電位酸性水(EOW)浸泡 3min,轉(zhuǎn)移到新的均質(zhì)袋中,然后加入 90mL經(jīng)高壓滅菌的蛋白胨溶液,進(jìn)行 2min的破碎處理,使萵苣葉破碎完全,形成懸浮溶液。對處理過的萵苣葉進(jìn)行菌數(shù)測定,同時(shí)判定高氧化還原電位酸性水的殺菌能力。本實(shí)驗(yàn)選定 4、10、15、20、25、30、35℃不同的培養(yǎng)溫度,根據(jù)不同的溫度選定不同的測試時(shí)間段,每隔一定時(shí)間分別取出一定量樣品進(jìn)行菌數(shù)測定,取合適稀釋度,用平板計(jì)數(shù)法得出活菌數(shù)。

1.2.5 初級模型的建立 利用 GraphPad Pris m (version 4,GraphPad Sof tware,Inc.,San Diego,CA, U.S.A.)和 DMFit(Version2.1.,InstituteofFood Research,Nor wich Research Park Nor wich NR4 7UA, United Kingdom.)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行初級模型的擬合,并利用實(shí)驗(yàn)得到的原始數(shù)據(jù)建立 Gompertz[16], Logistic[17]和 Barayi[18]三種初級模型。對三種模型得出的 R2進(jìn)行比較,選取最能符合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的模型,得出其不同溫度下的生長曲線,得到相應(yīng)的初級模型參數(shù)。

Gompertz模型：

Logistic模型：

Baranyi模型：

式中：y表示最終菌落數(shù)(log CFU/g);ymax表示生長過程中的最大菌落數(shù) (log CFU/g);y0表示最初菌落數(shù) (log CFU /g);μ表示最大比生長速率(log CFU/h);λ表示延滯期 (h);v是底物的增長速率;A,a,b是模型的參數(shù)。

1.2.6 二級模型的建立 二級模型的擬合使用 SPSS 16.0 package program(Statistical package for the social science,Chicago, IL,USA)統(tǒng)計(jì)軟件,研究溫度 (T)對最大比生長速率(SGR)的影響,得到平方根模型。

1.2.7 模型的驗(yàn)證 在模型的驗(yàn)證階段,判定系數(shù)(R2)、均方誤差 (Mean Square Error,MSE)、偏差因子 (Bias factor,BF)和準(zhǔn)確因子 (Accuracy factor,AF)將被用來作為衡量模型的標(biāo)準(zhǔn)。BF是偏差因子,表示實(shí)測值是大于預(yù)測值 (bias factor＞1)或者小于預(yù)測值(bias factor＜1);AF是精確因子,表示預(yù)測值和實(shí)測值的偏離度。公式如下：

表 1 Gompertz,Logistic和Baranyi模型在不同溫度下的判定系數(shù)值(R2)

表 2 由 Gompertz模型所得出的李斯特菌在不同溫度下的生長參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 初級模型的建立

接種后的萵苣葉李斯特菌濃度大約為 5.0 log cfu/g,經(jīng)過 EOW處理后,其濃度大致為 2.9 log cfu/g,說明EOW對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.1 log cfu/g,具有很強(qiáng)的殺菌能力。該結(jié)果與 Guentzel[18]在 2008年發(fā)表的研究成果相似,他們發(fā)現(xiàn)相同濃度的 EOW在相似條件下對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.3 log cfu/g。

將建立的 Gompertz,Logistic和 Baranyi三種模型進(jìn)行比較,如表 1所示。通過不同模型在各個(gè)溫度下的判定系數(shù) R2進(jìn)行縱向比較,可以看出 Gompertz模型所得 R2值較另外兩個(gè)模型更接近 1,并且Logistic模型和Baranyi模型在 30℃時(shí)并不能表達(dá)李斯特菌的生長曲線,所以選擇 Gompertz模型為本研究的初級模型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同溫度下李斯特菌的生長曲線和 Gompertz模型的吻合情況良好,Gompertz模型的平均判定系數(shù) R2高達(dá) 0.9913,使用 Pris m軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如圖 1所示。在 4℃和10℃的培養(yǎng)條件下,李斯特菌生長非常緩慢,在培養(yǎng)的前 50h,李斯特菌數(shù)目基本維持在初始水平,幾乎沒有出現(xiàn)生長態(tài)勢。隨著溫度的升高,李斯特菌的生長速度也加快,尤其是在 30℃和 35℃,只需要15h,李斯特菌就能生長到穩(wěn)定的水平。初級模型的擬合得到的模型參數(shù)如表 2所示,我們也可以清楚地看到隨著溫度的升高,最大比生長速率 (SGR)和最大菌體密度(MPD)隨之增加,相反,李斯特菌的生長延遲期(LT)縮短。

2.2 二級模型的建立

根據(jù)表 2中得到的不同溫度下的最大比生長速率 (SGR),利用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行線性回歸分析,從而得到關(guān)于溫度和 SGR平方根的二級模型 (如圖2所示)。由圖 2所示,圖中的點(diǎn)分布在 linear周圍很近的地方,說明溫度和李斯特菌的最大比生長速率的平方根有很好的線性關(guān)系;R2=0.981,表明二級模型的預(yù)測準(zhǔn)確度高達(dá) 98.1%,校正決定系數(shù)=0.977,說明僅有 2.3%的總變差不能解釋當(dāng)前的模型[19]。

圖 1 Gompertz模型所描述的李斯特菌在不同溫度下的生長曲線

圖2 二級模型的擬合

平方根模型[20-21]是用來描述環(huán)境因子影響的主要模型,其描述溫度影響的簡單表達(dá)式為：

其中,k是生長速率 (The rate of growth),b是回歸系數(shù) (Regression constant),T是溫度 (℃),T0是微生物生長理論最低溫度。由上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到李斯特菌在萵苣上生長模型的二級模型為：0.015T+0.069。

2.3 二級模型的驗(yàn)證

對模型的驗(yàn)證是一個(gè)非常重要的步驟,只有通過了驗(yàn)證,所建立的模型才會有價(jià)值。在本研究中, R2、MSE、BF和 AF用來作為衡量模型的工具,其中BF和 AF被認(rèn)為是驗(yàn)證模型的非常有價(jià)值的工具[21-24]。用所得的二級模型計(jì)算出相應(yīng)溫度下的預(yù)測值,與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較。如圖 3所示,R2值達(dá)到0.9769,預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)性很高。

圖 3 單增李斯特菌預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性分析

Adair[23]等報(bào)道,MSE的值越小,說明模型表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表達(dá)得越充分。如表 3所示,MSE的值為0.0003,說明預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)觀察值非常相似,均方誤差很小,說明該模型能夠很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表3 二級模型的MSE、AF和BF值

偏差因子(BF)是衡量模型的一個(gè)非常重要的參數(shù),Ross[25]認(rèn)為,對于微生物生長模型的驗(yàn)證,如果BF值在 0.9～1.05的范圍之內(nèi),認(rèn)為該模型能夠很好地預(yù)測微生物生長速度和生長狀況;如果 BF值在0.7～0.9或者 1.06～1.15范圍之內(nèi),則該模型是可以被接受的;如果BF值大于 1.15或者小于 0.7,則說明該模型是失敗的。由表 3可知,本實(shí)驗(yàn)所得 BF值為1.0398,在 0.9～1.05的范圍之內(nèi),說明建立的模型能夠很好的預(yù)測微生物生長速度和生長狀況。當(dāng) AF =1的時(shí)候,說明模型有很高的精確性,數(shù)值越大或越小,說明該模型的準(zhǔn)確性越低。如表 3所示,AF= 1.1068,意味著平均起來將有 10.68%的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值不符,這是一個(gè)比較理想,可以接受的結(jié)果。Dalgaard和 J?rgensen[26]所建立的關(guān)于李斯特菌在各種各樣的海產(chǎn)品中的生長模型,計(jì)算得出的AF值在1.4～4.0之間;Ross[25]所建立的葡萄球菌的生長模型,在驗(yàn)證當(dāng)中得出了 1.53的 AF值;而 Neumeyer[27]關(guān)于假單胞菌的模型驗(yàn)證中的AF值為 1.3。相比較之下,由于平方根模型本身能夠很好地描述環(huán)境因子對微生物生長的影響,準(zhǔn)確因子的值為 1.1068,表明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型具有相當(dāng)高的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

3.1 利用高氧化還原電位酸性水 (EOW)處理接種單增李斯特菌的萵苣樣品,得到 EOW對李斯特菌的滅活數(shù)為 2.1log cfu/g,說明高氧化還原電位酸性水(EOW)具有很強(qiáng)的殺菌能力。

3.2 建立了 Gompertz,Logistic和 Baranyi三種初級模型描述單增李斯特菌在不同溫度下的生長情況。對比結(jié)果表明,Gompertz模型的判定系數(shù) R2= 0.9913,能夠更好地?cái)M合李斯特菌在各個(gè)溫度下的生長狀況。得到得到李斯特菌在萵苣上存生長模型的二級模型為：對模型進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,該二級模型能夠很好地預(yù)測單核細(xì)胞增生李斯特菌在相應(yīng)環(huán)境下的生長狀況。預(yù)測食品微生物學(xué)的優(yōu)點(diǎn)在于利用存在的數(shù)據(jù)去預(yù)測未來發(fā)展趨勢,對實(shí)際生產(chǎn)和流通過程進(jìn)行監(jiān)控,具有重要的意義,也是未來的安全和質(zhì)量控制的發(fā)展方向之一。綜上所述,通過該研究所得出的關(guān)于李斯特菌的生長預(yù)測模型具有一定的價(jià)值,能夠?yàn)閷砩詈蛯?shí)驗(yàn)中李斯特菌的生長情況提供科學(xué)的預(yù)測。

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Study on predictive modelof the grow th of Listeria monocytogenes in ready-to-eat lettuce treated w ith electrolyzed oxidizing water

D ING Tian1,2,DONG Qing-li1,XI ANG Qi-sen3,W U De-huan2,＊
(1.Institute of Food Science and Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.Department of Food Science and Biotechnology,Kangwon NationalUniversity,Chuncheon,Gangwon 200701,Korea; 3.College of Food Science and Engineering,NorthwestA&F University,Yangling 712100,China)

The ob jec tive of this s tudy was to obse rve the ant im ic rob ia l effec t of e lec trolyzed oxid izing wa te r(EOW) aga ins tLis te ria m onocytogenes in ready-to-ea t le ttuce,and deve lop p red ic tive m ode ls of the g row th kine tic of L.m onocytogenes le ttuce trea ted w ith EOW.She lf life tes ts we re done a t seven d iffe rent s torage temp e ra tures,and p r im a ry m ode ls(Gomp e rtz,Log is tic and Ba ranyi)we re deve lop ed in orde r to find the bes t-fit m ode l to desc ribe the g row th kine tic of L.m onocytogenes.The comp a rison result ind ica ted tha t Gomp e rtz m ode l could fit the g row th kine tics of L.m onocytogenes bes t a t d iffe rent temp e ra tures w ith a high corre la tion coeffic ient va lue(R2=0.9913). The g row th p a ram e te rs(SGR,LT,M PD)we re ob ta ined us ing Gomp e rtz m ode l.Then SPSS was emp loyed to deve lop the seconda ry m ode l exp ress ing the re la tions be tween squa re root of SGR and temp e ra ture： SGR= 0.015T+0.069.Us ing the ind ices such as M ean Squa re Error(MSE),B ias fac tor(BF),Accuracy fac tor(AF)to va lida te the currentm ode l,the results dem ons tra ted tha t the m ode l deve lop ed was qua lified enough to p red ic t the g row th of L.m onocytogenes in p rac tice in the future.

L.m onocytogenes;e lec trolyzed oxid izing wa te r;le ttuce;p red ic tive m ode l;va lida tion

TS201.3

A

1002-0306(2010)03-0087-05

單核細(xì)胞增生李斯特菌 (單增李斯特菌,L isteria m onocytogenes,Lm)是一種分布廣泛的食源性病原菌,人感染后能引發(fā)腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎等臨床癥狀,感染后發(fā)病死亡率約為 25%[1-2]。單增李斯特菌廣泛存在于自然界土壤、水、植物和反芻動物、人的糞便中,主要是通過污染乳制品、畜禽產(chǎn)品、生熟肉、蔬菜引起人類致病,由于該菌在 4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖[3],所以它是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。近幾年來,因食品污染單增李斯特菌而引起的食物中毒暴發(fā)事件日見增多,已引起國際社會的廣泛關(guān)注[4-5]。因此,2000年 WHO食品安全工作計(jì)劃將單增李斯特菌列為必檢的食源性致病菌之一。預(yù)測食品微生物學(xué) (Predictive Food Microbiology)是運(yùn)用微生物學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和應(yīng)用計(jì)算機(jī)學(xué)建立起來的新興學(xué)科[6-7]。它的主要研究內(nèi)容是利用數(shù)學(xué)模型定量描述和預(yù)測微生物在特定食品特性 (pH、水分活度等)和加工流通環(huán)境因子(溫度、包裝氣體等)條件下生長和存活的模型[7]。預(yù)測食品微生物學(xué)在食品安全的預(yù)測和管理中有很大的應(yīng)用價(jià)值,可以用來預(yù)測食品的貨架壽命和微生物學(xué)安全,同時(shí)是管理食品安全的重要工具,它為微生物風(fēng)險(xiǎn)評估 (Quantitative M icrobial Risk Assess ment,QMRA)和 HACCP(HazardAnalysis Critical Control Point)提供了科學(xué)依據(jù)[9-10]。高氧化還原電位酸性水 (Electrolyzed Oxidizing Water, EOW),是用強(qiáng)電解水生成裝置電解食鹽水而成的具有高電位強(qiáng)氧化性和 pH在 2.0～3.5的酸性水[11]。高氧化還原電位酸性水具有無毒、不污染環(huán)境、殺菌效果好等特點(diǎn),在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)作物、家畜和食品等諸多領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景[12-15]。本文研究高氧化還原電位酸性水(EOW)處理對萵苣樣品中單增李斯特菌的殺菌效果,并建立了單核細(xì)胞增生李斯特菌在萵苣上的生長預(yù)測模型,經(jīng)驗(yàn)證,所得模型能夠很好地表達(dá)單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長狀況,具有一定的應(yīng)用價(jià)值,并能對將來生活和實(shí)驗(yàn)中李斯特菌的生長做出可靠的科學(xué)預(yù)測。

2009-04-08 ＊通訊聯(lián)系人

丁甜(1985-),男,博士研究生,研究方向：食品微生物風(fēng)險(xiǎn)評估。

國家自然科學(xué)基金 (30800864)。