植物提取物對(duì)芒果致腐菌的抑制作用研究

李?yuàn)W峰,黃 麗,滕建文,韋保耀

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

植物提取物對(duì)芒果致腐菌的抑制作用研究

李?yuàn)W峰,黃 麗＊,滕建文,韋保耀

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

對(duì)植物提取物在抑制芒果病害領(lǐng)域進(jìn)行了初步研究。以芒果褐色蒂腐菌 (Phomopsis mangiferae Ahmad)和膠孢炭疽菌(Collgtotrichum gloeosporioides Penz)為研究對(duì)象,采用管蝶法評(píng)價(jià) 30種植物的水提物和醇提物的離體抑菌效果。并使用孔板連續(xù)培養(yǎng)法測(cè)定相應(yīng)的最低抑菌濃度(M IC)和最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明：有 14種水提物和 7種醇提物對(duì)芒果致腐菌有抑制作用。其中丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香的水提物以及肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香的醇提物對(duì)膠孢炭疽菌均有抑制效果;丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的水提物以及肉豆蔻、蘆薈、大茴香的醇提物對(duì)褐色蒂腐菌有不同程度的抑制作用。

植物提取物,芒果,褐色蒂腐菌,膠孢炭疽菌,抑菌

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果褐色蒂腐菌 (Phom opsis m angiferae Ahm ad)取自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物保藏實(shí)驗(yàn)室;芒果膠孢炭疽菌 (Collgtotrichum gloeosporioides Penz) 取自廣西農(nóng)科院;30種植物的水提物和醇提物粉末 均購(gòu)自西安和霖生物工程有限公司,均為標(biāo)準(zhǔn)制備工藝生產(chǎn)的天然植物提取物,分別是丁香、黃芩、桂皮、高良姜、大茴香、板藍(lán)根、金銀花、黃連、五倍子、藿香、厚樸、白芷、蘆薈、益母草、肉豆蔻、蒼術(shù)、苦參、魚(yú)腥草、百部、虎杖、黃連、白背葉、益智、山柰、三七、烏梅、鹿蹄草、龍膽草、大黃、牡丹皮。

YXQ-LS-5051型立式壓力蒸汽滅菌器,HDP-2000型恒溫培養(yǎng)箱,水平層流凈化工作臺(tái),電冰箱,酒精燈,培養(yǎng)皿,試管,涂布棒,移液槍,12孔板,接種環(huán),牛津杯,瓊脂粉,蔗糖等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的配制 取斜面培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)旺盛的病原菌,吸取生理鹽水 20mL將斜面上孢子沖洗到三角瓶中,再加入 80mL生理鹽水加以稀釋,在洗斜面孢子時(shí)可用滅菌接種環(huán)適當(dāng)刮洗。以此為菌懸液主液,制成一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室上面,用細(xì)口滴管吸取少量充分振蕩混勻的菌液,滴加在蓋玻片的邊緣上,讓菌液由蓋玻片與計(jì)數(shù)板的縫隙間滲入計(jì)數(shù)室,靜置片刻,待菌體自然沉降并穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)數(shù)。做 2次平行實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)做 3個(gè)重復(fù),取平均值。最終獲得孢子含量為 106～107cfu/mL的菌懸液[5]。

1.2.2 管碟法測(cè)定植物提取物對(duì)芒果病原菌生長(zhǎng)的抑制作用 吸取 200μL的指示菌菌懸液至 PDA平板上,用無(wú)菌玻耙涂布均勻,并用鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中,在水平放置的平皿中均勻地放置 3只牛津杯。用無(wú)菌水將提取物稀釋為 100mg/mL濃度的溶液,每種取 200μL至牛津杯中,對(duì)照組(CK)的牛津杯中加 200μL無(wú)菌水,陰性對(duì)照組 1 ()使用稀釋度為 1∶700的多菌靈,陰性對(duì)照組 2 ()使用稀釋度為 1∶700的撲海因,每種植物提取物進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。注意不要將液體溢出牛津杯外,然后將平板置于最適生長(zhǎng)溫度 28℃下培養(yǎng),膠孢炭疽菌培養(yǎng)48h,褐色蒂腐菌培養(yǎng)60h,根據(jù)十字交叉法用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的大小[6]。

1.2.3 孔板連續(xù)培養(yǎng)法測(cè)定植物提取物對(duì)芒果病原菌生長(zhǎng)的最低抑菌濃度 (M I C)和最低殺菌濃度(MBC) 采用 12孔板連續(xù)稀釋法[7]。以無(wú)菌水為溶劑,配制一系列梯度濃度的提取物溶液,將該梯度濃度的提取物溶液加入已融化好的液體 PDA培養(yǎng)基中,在每一提取物濃度梯度作 3組平行實(shí)驗(yàn),向每個(gè)孔中依次加入 300μL的提取物溶液與培養(yǎng)基的混合溶液和 10μL的菌懸液。對(duì)照組 (CK)添加無(wú)菌水,陰性對(duì)照組 1()添加多菌靈,陰性對(duì)照組 2 ()添加撲海因,用保鮮袋封口,28℃下培養(yǎng) 48h,觀(guān)察結(jié)果,與三個(gè)對(duì)照組比較,有菌落生長(zhǎng)者無(wú)抑制作用,以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低提取物濃度為其最低抑菌濃度(M I C),繼續(xù)培養(yǎng)36h后,取0.2mL涂布PDA平板,如仍不長(zhǎng)菌的即為最低殺菌濃度(MBC)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 管碟法測(cè)定植物提取物對(duì)芒果病原菌生長(zhǎng)的抑制效果

采用 SPSS17.0的 Duncan Test及單因素方差分析對(duì) 1～30號(hào)提取物各自的抑菌效果進(jìn)行分析,篩選出有效的提取物并記錄各自的效力,結(jié)果見(jiàn)表 1和表2。

由表 1可以看出,在 30種植物水提取物中,有抑制效果的有 14種。對(duì)膠孢炭疽菌有效用的有 10種,其中虎杖、知母、白芷具有等效的抑制作用 (同為 E級(jí));烏梅、牡丹皮具有等效的抑制作用 (同為 D級(jí));丁香水提取物的抑菌圈最大 (9.11mm),抑菌效果最好;丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用依次減弱。與對(duì)比實(shí)驗(yàn)的兩種廣譜農(nóng)藥的效果相比,丁香,肉豆蔻,金銀花的抑菌效果要稍好于撲海因,但是遠(yuǎn)低于多菌靈。

表 1 植物水提物對(duì)芒果致腐菌的離體抑菌效果

表 2 植物醇提物對(duì)芒果致腐菌的離體抑菌效果

對(duì)褐色蒂腐菌有效用的水提取物有 9種,丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黃岑、高良姜的抑制效果逐漸降低。丁香的抑菌效果最好,抑菌圈為 10.41mm。與對(duì)比實(shí)驗(yàn)的兩種廣譜農(nóng)藥的效果相比,丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的效果比撲海因明顯,但是遠(yuǎn)低于多菌靈。

由表 2可以看出,在 30種植物醇提物中,有 7種對(duì)芒果致腐菌有抑制作用。對(duì)膠孢炭疽菌有效用的有 6種,丁香、桂皮具有同樣的抑菌效果 (同為 D級(jí));肉豆蔻、黃岑、大黃具有等效的抑菌效果 (同為E級(jí));肉豆蔻醇提物的抑菌圈為 9.57mm,其抑菌效果最好;肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香、蘆薈的抑菌效果逐漸降低。與對(duì)比實(shí)驗(yàn)的兩種廣譜農(nóng)藥的效果相比,肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香這 5種醇提物的抑菌效果均比撲海因好,比多菌靈差。

對(duì)褐色蒂腐菌有效用的醇提取物有 3種,肉豆蔻、蘆薈、大茴香的抑制效果逐漸降低;肉豆蔻的抑菌效果最好,抑菌圈為 14.25mm。與對(duì)比實(shí)驗(yàn)的兩種廣譜農(nóng)藥的效果相比,肉豆蔻、蘆薈、大茴香的效果明顯比撲海因高,但是稍低于多菌靈。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同種類(lèi)植物提取液對(duì)同一芒果致腐菌的抑制作用存在著差異,同一植物用不同溶劑提取得到的物質(zhì)對(duì)同種病原菌的抑菌活性亦存在較大差異。對(duì)于供試相同質(zhì)量濃度的植物提取液,對(duì)褐色蒂腐菌的抑制作用明顯強(qiáng)于膠孢炭疽菌,說(shuō)明兩種芒果致腐菌的生命力和抗藥性存在顯著性差異。

2.2 孔板培養(yǎng)法測(cè)定有抑菌效果的植物提取物的M IC、MBC

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,篩選出對(duì)褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌有抑制效果的植物提取物,對(duì)其最低抑菌濃度(M I C)和最低殺菌濃度 (MBC)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表 3和表 4所示。

表 3 有效的植物水提物對(duì)芒果致腐菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

表 4 有效的植物醇提物對(duì)芒果致腐菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

由表 3可以看出,在對(duì)褐色蒂腐菌有抑制效果的水提物中,褐色蒂腐菌對(duì)丁香和肉豆蔻最為敏感,其最低抑菌濃度最小,為 50mg/mL;桂皮、金銀花、牡丹皮水提物的最低抑菌濃度同為 100mg/mL,其中金銀花的最低殺菌濃度大于 200mg/mL。在對(duì)膠孢炭疽菌有抑制效果的水提物中,丁香、金銀花、肉豆蔻、烏梅的最低抑菌濃度最小,同為 50mg/mL;金銀花的最低殺菌濃度最小。

由表 4可以看出,在對(duì)褐色蒂腐菌有抑制效果的醇提物中,肉豆蔻、黃岑、大黃醇提物的最低抑菌濃度最小,同為 25mg/mL,并且肉豆蔻醇提物的最低殺菌濃度最小。丁香、桂皮醇提物的最低抑菌濃度同為 50mg/mL,最低殺菌濃度同為 100mg/mL?？梢?jiàn)褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌均對(duì)肉豆蔻醇提物最為敏感。

多菌靈對(duì)這兩種芒果致腐菌表現(xiàn)出了極高的殺菌效力,其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為本實(shí)驗(yàn)的最小稀釋濃度。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)芒果膠孢炭疽菌的離體抑菌實(shí)驗(yàn),篩選出了對(duì)其有抑菌效果的 10種水提物和 6種醇提物。水提物的抑菌效果強(qiáng)度由強(qiáng)到弱為：丁香、肉豆蔻、金銀花、知母、白芷、虎杖、烏梅、牡丹皮、黃連、藿香;醇提物對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌效果強(qiáng)度由強(qiáng)到弱為：肉豆蔻、黃岑、大黃、桂皮、丁香、蘆薈。通過(guò)對(duì)芒果褐色蒂腐菌的離體抑菌實(shí)驗(yàn),篩選出了對(duì)其有抑菌效果的 9種水提物和 3種醇提取物。水提物的抑菌效果強(qiáng)度由強(qiáng)到弱為：丁香、桂皮、金銀花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黃岑、高良姜;醇提物的抑菌效果強(qiáng)度由強(qiáng)到弱為：肉豆蔻、蘆薈、大茴香。褐色蒂腐菌和膠孢炭疽菌均對(duì)肉豆蔻醇提物最為敏感,當(dāng)肉豆蔻醇提物的濃度為 25mg/mL時(shí),可殺死全部的芒果致腐菌。

同一種植物用不同的溶劑進(jìn)行提取,獲得的有效抑菌成分也不盡相同,如本實(shí)驗(yàn)中肉豆蔻的醇提物的抑菌效果遠(yuǎn)好于其水提物。而大黃水提物對(duì)膠孢炭疽菌的沒(méi)有抑制作用,而醇提物對(duì)其抑制作用卻很明顯。原因可能是用水提取的生物堿鹽、甙類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸、多糖類(lèi)等物質(zhì)比較雜,有些物質(zhì)對(duì)真菌的抑制能力不強(qiáng);而醇提取的鹽、甙類(lèi)、揮發(fā)油及有機(jī)酸類(lèi)的活性物質(zhì)能侵入微生物的細(xì)胞質(zhì)膜,使其細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,抑制了微生物的 TCA呼吸途徑中酶的活性,阻斷了糖代謝途徑,使其不能生長(zhǎng)繁殖。

在篩選天然植物保鮮劑時(shí),不能只注重室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果,離體實(shí)驗(yàn)中抑菌作用強(qiáng)的提取物保鮮劑,對(duì)芒果活體采后病害的防治效果卻很難預(yù)料。因此有必要結(jié)合其在采后防腐的實(shí)際應(yīng)用效果,對(duì)天然植物的抗菌作用機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系、化學(xué)仿生合成等進(jìn)行細(xì)致深入的研究。用植物中提取有抑菌作用的活性物質(zhì),直接或間接加工合成的新型保鮮劑,使其具有在環(huán)境中生物降解快,對(duì)人畜及非靶標(biāo)生物毒性低,不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn),為天然植物提取物在果蔬保鮮方面的真正實(shí)踐應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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Study on inhibition effect of plant extracts againstm ango pathogens

L IAo-feng,HUANG L i＊,TENG Jian-wen,W EI Bao-yao
(Institute ofLight Industry and Food Engineering,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

The s tudy eva lua ted the ant im ic rob ia l ac tivity of30kinds of p lants’wa te r extrac ts and e thanol extrac ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad,Collg totrichum g loeosp orioidesPenz by cup-p la te m e thod in vitro exp e r im ents.O rifice Pla te continuous culture m e thod was used to de te rm ine the irm in im um inhib ition concentra tion (M IC)and m in im a l bac te ric ida l concentra tion(MBC).In vitro exp e r im ents showed tha t14kinds of p lants’wa te r extrac ts and 7kindsof e thanol extrac tshad inhib ition effec tsaga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm adsand Collg totrichum g loeosp orioides Penz.Syringa,M yris tica,Lom ice ra,Rhizom a,Ange lica,Polygonum,Prunus,Cortex m outan,Cop tis,Agas tache’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,Scute lla ria,Rheum,C innam om um cass ia,Syringa’e thanol extrac ts had inhib ition effec ts aga ins t Collg totrichum g loeosp orioides Penz;Syringa,C innam om um cass ia, Lom ice ra,Cortex m outan,Rhizom a,M yris tica’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,A loe,Illic ium’e thanol extrac ts have inhib ition effec ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad.

p lantextrac ts;m ango;Phom op s is m ang ife rae Ahm ad;Collg totrichum g loeosp orioides Penz; bac te ria l inhib ition

TS255.3

A

1002-0306(2010)03-0076-04

芒果極不耐貯運(yùn),采后易發(fā)生腐爛變質(zhì),長(zhǎng)期以來(lái),芒果的貯藏保鮮問(wèn)題一直未能得到很好的解決,這不僅造成資源損失、環(huán)境污染,而且致使大量芒果收獲后無(wú)法進(jìn)入全國(guó)性供應(yīng)。由病原微生物引起的病理性病害是造成芒果腐敗變質(zhì)的主要原因,芒果炭疽病和芒果蒂腐病是果生產(chǎn)區(qū)發(fā)生最普遍、危害性最大的一種病害,在我國(guó)各芒果種植區(qū)均有發(fā)生[1]。我國(guó)植物資源十分豐富,可供于開(kāi)發(fā)利用的資源非常多。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)于有天然抗菌保鮮劑的應(yīng)用研究十分盛行,Hammer[2]對(duì) 52種植物精油的抗菌活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)巖蘭草油、胡荽、月見(jiàn)草、杏樹(shù)油、牛至、丁香等精油對(duì)金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌等微生物有顯著的抑制作用。Ates[3]對(duì)幾種藥用植物提取液的抗菌活性研究中發(fā)現(xiàn),桂皮提取液對(duì)芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用。孔秋蓮[4]等發(fā)現(xiàn)丁香、肉桂的提取物可抑制黑曲霉和擴(kuò)展青霉的孢子萌發(fā),五倍子、川芎的提取物可抑制黑曲霉和擴(kuò)展青霉的孢子形成。通過(guò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn),選取了 30種抑菌效果較好的植物水提物和醇提物作為抑菌劑,進(jìn)一步擴(kuò)大了活性物質(zhì)獲得的范圍。將芒果病害研究和天然植物提取物貯藏保鮮應(yīng)用研究進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,從中篩選出有效的植物種類(lèi),解析抑菌效果,為研究這些提取物中的有效成分和活性物質(zhì),進(jìn)一步篩選確定其化學(xué)成分和物質(zhì)的結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ),為克服芒果貯藏過(guò)程的病害發(fā)生以及開(kāi)發(fā)天然芒果保鮮劑等提供理論依據(jù)。

2009-06-29 ＊通訊聯(lián)系人

李?yuàn)W峰(1984-),男,碩士研究生,研究方向：亞熱帶水果蔬菜保鮮技術(shù)。

國(guó)家科技部攻關(guān)百色專(zhuān)項(xiàng);廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目 (桂科攻0424006-1D)。