烏司他丁對體外循環(huán)下心肌缺血再灌注損傷患者基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響

孫 亮,劉 萍,常忠路,張衍魯,陳慶偉

體外循環(huán)(extracorporeal circulation,ECC)下心肌缺血再灌注損傷主要與鈣超載、氧自由基大量產(chǎn)生和內(nèi)皮細(xì)胞激活有關(guān)。近年研究表明金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)及活性增強,參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)展過程。在ECC期間如何防治心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展一直為心臟外科醫(yī)師所關(guān)注?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一組鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族,其主要功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解,對于生理情況下細(xì)胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的維持有重要的作用。MMP-9是 MMP家族的重要成員,其主要功能是降解Ⅳ型膠原,與多種生理和病理過程有[1-2]。近年來,有關(guān) MMP在ECC心肌缺血再灌注損傷中的作用逐漸受到重視。烏司他丁(ulinastatin,UTI)是一種廣譜的蛋白酶抑制劑,對胰蛋白酶、纖溶酶、激肽釋放酶等有較強的抑制作用,穩(wěn)定溶酶體膜,從而抑制了多種炎性介質(zhì)釋放對組織器官的損害,UTI對由于 ECC導(dǎo)致的各種蛋白酶及炎性介質(zhì)對機體的損傷有明顯的抑制作用。本研究旨在探討 UTI對圍 ECC期患者血漿中MMP-9變化的影響。

1 對象與方法

1.1 試劑、藥品與器械 注射用 UTI(天普洛安,100 ku/支,粉針劑,廣東天普生物化學(xué)醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))。血漿 MMP-9含量采用 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。Drager麻醉機 Fabius 2 000(德國 Drager公司生產(chǎn)的電動電控型)。StockertⅢ人工心肺機(Stockert公司,德國)和希健-Ⅰ膜式氧合器(西京公司,中國)。

1.2 對象及分組 收集本院心臟外科 2008年1月至 11月接受 ECC下行心臟手術(shù)的患者 30例,男 18例,女 12例。其中雙瓣置換術(shù) 10例,單瓣置換術(shù)12例,法洛四聯(lián)癥根治術(shù) 4例,冠狀動脈旁路移植術(shù) 4例。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前有肝、腎功能障礙、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、長期使用激素史、慢性支氣管炎、哮喘史、近期有肺部感染、ECC時間短于 30 min或長于 150 min者。以隨機概率表隨機分為 UTI組和對照組,每組 15例。UTI組按患者體重 12 ku/kg計算總用量,用 20m l生理鹽水稀釋后,在頸內(nèi)靜脈插管成功后麻醉誘導(dǎo)時由頸內(nèi)靜脈緩慢推入總量的 1/2,ECC開始時即刻將剩余量 1/2加入預(yù)充液中。相對應(yīng)注入等量的生理鹽水作為對照組。

1.3 麻醉與ECC方法 所有患者術(shù)前常規(guī)禁食8 h,禁飲 6 h,麻醉前 30 min肌注嗎啡 0.1 mg/kg,東莨菪堿 0.007mg/kg。氣管插管、靜脈復(fù)合麻醉,麻醉誘導(dǎo)用藥為咪噠唑侖 0.03～0.05mg/kg,依托咪酯 0.3 mg/kg,舒芬太尼 0.6～1μg/kg,哌庫溴銨0.15mg/kg,麻醉維持采用靜脈方法,間斷靜注舒芬太尼,持續(xù)泵注異丙酚 3～5 mg/(kg·h),間斷追加哌庫溴銨維持肌松。麻醉成功后正中剖胸,肝素化(3mg/kg)至活化凝血時間(ACT)＞400 s,升主動脈及上、下腔靜脈置管常規(guī)建立 ECC,中或淺低溫(24～32℃),中度血液稀釋[紅細(xì)胞比容(Hct)為0.2～0.3],非搏動灌注,流量為 60～90m l/(kg·min)。心臟停搏液采用 4℃晶體高鉀停搏液于主動脈根部灌注,使心電呈等電位,心臟局部敷冰屑維持心肌局部深低溫。心內(nèi)操作完成后左心排氣,開放升主動脈,復(fù)溫至36℃停止 ECC。常規(guī)用魚精蛋白 1：1比例拮抗肝素,必要時追加少量魚精蛋白。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)測定 分別記錄切皮至 ECC開始時間,ECC的時間,主動脈阻斷時間,手術(shù)時間,觀察術(shù)后患者的預(yù)后等。分別在 ECC開始前(T1)、主動脈阻斷前 1 Min(T2)、主動脈開放后 1 min(T3)、ECC結(jié)束時(T4)、ECC結(jié)束后 2 h(T5)及 6 h(T6)6個時間點各采集 5ml動脈血置于肝素化試管中,1 h內(nèi)離心(3 000 r/min,10min),取血漿樣本置于-70℃下保存?zhèn)溆谩?biāo)本復(fù)溫后集中按照試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)使用說明,采用 ELISA法檢測樣本中 MMP-9的濃度。測定值按 Taylor公式校正,公式為:

稀釋后物質(zhì)含量校正值 =實測值 ×術(shù)前 Hct/取樣時 Hct

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件分析,所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組內(nèi)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者的年齡(44.2±10.6)歲 vs(45.1±11.3)歲 、男 /女性別比(9/6)例 vs(9/6)例、體重(54.7±10.3)kg vs(55.2±11.4)kg、手術(shù)類型(雙瓣置換術(shù)每組各 5例、單瓣置換術(shù)每組各 6例、法洛四聯(lián)癥根治術(shù)每組各 4例、冠狀動脈旁路移植術(shù)每組各 2例)、ECC時間(77.9±25.4)min vs(76.7±24.1)min、主動脈阻斷時間(55.3±18.7)min vs(57.1±19.2)min、手術(shù)時間(220.6±40.1)Min vs(230.9±45.7)min,均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 兩組患者不同時間點血漿 MMP-9濃度比較 所有患者術(shù)中經(jīng)過順利,圍術(shù)期循環(huán)功能維持良好,兩組患者均無術(shù)后早期死亡。兩組患者M(jìn)MP-9濃度在 T2、T3、T4、T5和 T6均較 T1時明顯升高(P＜0.05),均在 T4時達(dá)高峰。兩組MMP-9濃度在 T1時差異無顯著性(P＞0.05)。UTI組在 T2、T3、T4、T5和 T6時均明顯低于對照組(P＜0.05)。見表1。

3 討 論

目前 ECC下心肌缺血再灌注損傷仍是一個難以避免的并發(fā)癥,在 ECC期間如何防治心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展一直為心臟外科醫(yī)師所關(guān)注。所以適當(dāng)應(yīng)用藥物干預(yù)對預(yù)防和減輕心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。

表1 兩組患者不同時點血漿MMP-9濃度(ng/L,n=15,±s)

表1 兩組患者不同時點血漿MMP-9濃度(ng/L,n=15,±s)

注:與對照組比較*P＜0.05;與T1比較#P＜0.05

對照組 50.8±11.2 80.6±21.5# 171.3±53.2# 403.9±132.3# 310.9±61.3# 142.3±48.6#UTI組 51.4±12.3 60.5±15.6*# 102.3±23.4*#213.8±71.6*# 122.9±30.3*# 73.2±18.7*#

MMP-9,又稱明膠酶 B,是 MMPs的主要成員,定位于人 16號染色體,它是 MMP家族中分子量最大的酶。分子量為 92 KDa大小,它以前酶原(80 KDa)的形式合成。含有一個 19個氨基酸的信號肽,后經(jīng)裂解掉此信號肽,多糖氨基化而變成 92 KDa的酶原形式。92 KDa的酶原降解掉氨基酸端 73個氨基酸產(chǎn)生酶的活化形式(84 KDa)[3]。它作用底物廣泛,包括 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型膠原、明膠、彈性蛋白等。MMP-9有 7個片段組成:信號肽片斷、一個裂解成激活酶的前肽片斷、鋅結(jié)合片斷、激活酶片斷、纖維連接片斷、類Ⅴ型膠原片斷、帶有羧基末端類血凝酶片斷,但這些片段的具體結(jié)構(gòu)功能尚未明確[3]。在正常情況下,MMP-9釋放量很少[4]。

心肌缺血再灌注損傷主要與鈣超載、氧自由基大量產(chǎn)生和內(nèi)皮細(xì)胞激活有關(guān)。近年研究表明MMPs的表達(dá)及活性增強,參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)展過程。Lu[5]等研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)豬心臟遭受 90 min的缺血,再灌注 90min后,心肌中的 MMP-9含量增加、酶活性增強,此與缺血再灌注心肌組織中MMPs組織抑制劑的含量減少及組織纖溶酶原激活物表達(dá)增高引起的瀑布效應(yīng)有關(guān)。Romanic等[6]研究亦顯示 MMP-9基因缺失能有效的保護(hù)缺血再灌注對心肌損傷的影響。MMP-9基因缺失鼠在心肌缺血 30min再灌注 24 h后,心肌梗死面積比野生型鼠減少了 35.4%,內(nèi)源性 MMP-9抑制劑的表達(dá)量是野生型鼠的 21.4倍。本實驗結(jié)果顯示,主動脈阻斷前 1min至 ECC后 6 h兩組患者 MMP-9濃度均較麻醉誘導(dǎo)前明顯升高,兩組均在主動脈開放后ECC結(jié)束時達(dá)高峰,其機制可能是因為心肌經(jīng)受了缺血再灌注損傷的打擊而發(fā)生組織損傷,血管內(nèi)皮組織損傷,或組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)(組織因子、氧自由基、蛋白酶),促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)并造成心肌組織損傷,這些都可能合成和釋放 MMP-9,成為 MMP-9增多的原因。這與先前的報道相一致。Lindsey等[7]通過動物實驗證實再灌注后 1 h MMP-9在血清及心肌組織中均增高,中性粒細(xì)胞浸潤是缺血再灌注損傷后 MMP-9的早期來源,在心肌層 MMP-9的一部分為激活型。中性粒細(xì)胞浸潤通過 MMP-9分泌型使 MMP-9聚集,是蛋白酶活化的來源。ECC過程中中性粒細(xì)胞激活釋放大量的 MMP-9,降解Ⅳ型膠原,破壞內(nèi)皮基底膜,導(dǎo)致組織水腫,在 ECC中 MMP-9的釋放明顯增加[8]。

烏司他丁是由 Beuer和 Reich于 1909年在人類尿液中發(fā)現(xiàn)的一種典型的 Kuniz型蛋白酶抑制劑,具有兩個活性功能區(qū)。兩個活性功能區(qū)均有廣譜抑酶作用,且不完全重疊,能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶 A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種蛋白酶的活性。烏司他丁降解形成的分子產(chǎn)物仍對上述各種蛋白酶有高效抑制作用,能改善休克時的微循環(huán)狀態(tài),對溶酶體膜有穩(wěn)定作用。大量研究表明,UTI具有抑制多種蛋白、糖和脂類的水解酶的活性,抑制炎性介質(zhì)的過度釋放及改善微循環(huán)和組織灌注的藥理作用,從而在 ECC中保護(hù)機體免受全身炎癥反應(yīng)的損傷[9]。本實驗結(jié)果顯示,烏司他丁組主動脈阻斷前 1 min至 ECC結(jié)束后 6 h時 MMP-9的濃度均明顯低于對照組,說明烏司他丁在 ECC過程中可明顯抑制 MMP-9的過度釋放。其機制可能為:烏司他丁通過穩(wěn)定溶酶體膜,抑制眾多酶活性,抑制粒細(xì)胞彈性蛋白酶和細(xì)胞自溶素 G,阻止中性粒細(xì)胞、單核粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞聚集,預(yù)防細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng),抑制白細(xì)胞過度激活及炎性介質(zhì)的釋放,阻斷細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)與白細(xì)胞之間的惡性循環(huán),從而抑制 MMP-9釋放和激活。Miura[10]也在研究中發(fā)現(xiàn)烏司他丁對由于 ECC介入而導(dǎo)致的各種蛋白酶及炎性介質(zhì)對機體的損傷有明顯的抑制作用,應(yīng)用烏司他丁后能明顯抑制腫瘤壞死因子-α的過度釋放,抑制中性粒細(xì)胞大量聚集和中性粒細(xì)胞脫殼粒作用,從而抑制 MMP-9的釋放。

本研究表明,ECC可致血漿中 MMP-9的濃度升高,而烏司他丁能明顯降低圍體外循環(huán)期患者 MMP-9的過度釋放,可能減輕心肌缺血再灌注損傷。

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