高碘酸鈉-氧化低分子肝素-抗凝血酶復(fù)合物涂層聚氯乙烯管道的生物相容性研究

羅 鵬,楊 劍,楊 春,周 華,曹瑞軍,劉維永

體外循環(huán)術(shù)后全身炎癥反應(yīng)是影響患者術(shù)后恢復(fù)的重要因素之一,這主要與體外循環(huán)系統(tǒng)人工材料的生物相容性欠佳有關(guān)。以往的研究表明,用肝素涂層技術(shù)對(duì)體外循環(huán)管道進(jìn)行表面改性,可以有效改善其生物相容性,減輕術(shù)后全身炎癥反應(yīng)[1]。但肝素涂層同時(shí)也存在對(duì)血漿蛋白吸附不具選擇性、抗凝效果不確切等問(wèn)題。1997年,Chan等[2]利用蛋白非酶糖基化反應(yīng)合成出了一種新型抗凝血酶-肝素共價(jià)復(fù)合物(antithrombin-heparin covalent complex,ATH),其具有強(qiáng)大的抑制凝血酶活性和血液相容性?xún)?yōu)異等特性[3]。本研究小組借鑒 ATH的合成方法,前期合成出了高碘酸鈉(NaIO4)-氧化低分子量肝素-抗凝血酶共價(jià)復(fù)合物(sodium periodate-dxidated low molecular weight heparin-antithrombin covalent complex,SPLMWATH),并研究發(fā)現(xiàn) SPLMWATH涂層體外循環(huán)醫(yī)用聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)管道的涂層穩(wěn)定性和抗凝血性能明顯優(yōu)于肝素涂層和低分子肝素涂層 PVC管道。本文采用 Chandlar loop模型進(jìn)行體外循環(huán),并檢測(cè)有關(guān)指標(biāo),進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 SPLMWATH涂層 PVC管道的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 醫(yī)用 PVC管道(西安路嘉生物醫(yī)學(xué)有限公司),人血漿抗凝血酶 III(human plasma antithrombin III,AT,Biodesign公司 ,美國(guó)),低分子量肝素鈉注射液(low molecular weight heparin sodium injection,LMWH,0.4ml:5 000 IU,齊魯制藥有限公司),40%聚乙烯亞胺溶液(polyethyleneimine,PEI,平均相對(duì)分子量 20 000 Da,武漢強(qiáng)龍化工有限責(zé)任公司),50%戊二醛溶液(glutaraldehyde,G,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心),NaIO4(分析純,上海順強(qiáng)生物科技有限公司),氰基硼氫化鈉(NaBH3CN,優(yōu)級(jí)純,Sigma-Aldrich公司,美國(guó)),人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京晶美生物工程有限公司),人白介素(IL)-8 ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳炬英生物科技有限公司),DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠(GE公司,美國(guó))。新鮮全血,來(lái)源于西京醫(yī)院臨床志愿者。S-520型掃描電子顯微鏡(HITACHI公司,日本),BIO-RAD 550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIOMED公司,美國(guó)),Sysmex K-4500全自動(dòng)血液分析儀(Sysmex公司,日本),Am icon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices(3K、10K,Millipore公司,美國(guó)),AKTA purifier 100蛋白快速純化系統(tǒng)(GE公司,美國(guó))。

1.2 聚乙烯亞胺-戊二醛(PEI-G)結(jié)合 PVC管道的制備 分別稱(chēng)取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40%的 PEI和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50%的 G 5 g和 10 g,用去離子水稀釋至5%,然后將 PEI逐滴加入到 G中,濾紙過(guò)濾,獲得棕黃色的重量百分率(wt)5%的 PEI-G溶液。將直徑 3mm,長(zhǎng) 50 cm的醫(yī)用 PVC管道一端封閉,另一端注入 PEI-G溶液,37℃中水浴 30 min后倒出剩余溶液,反復(fù) 3次,真空常溫下干燥備用[4]。

1.3 SPLMWATH涂層 PVC管道的制備

1.3.1 SPLMWATH的合成 將 10mg NaIO4溶于5ml低分子肝素鈉溶液,室溫避光反應(yīng)30 min,然后用 Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Devices(離心過(guò)濾裝置)(3K)在室溫下 4 000 r/min離心 20 min,丟棄超濾液,向保留液中補(bǔ)充去離子水,重復(fù)離心 2次,得到氧化低分子肝素鈉溶液。將 1mg抗凝血酶(AT)溶于氧化低分子肝素鈉溶液,然后將其配制成20ml 0.02 mol/L、pH 7.3的磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS),40℃反應(yīng) 14 d,再加入 2 ml 0.5 mol/L NaBH3CN溶液,37℃繼續(xù)反應(yīng) 5 h[2,5]。

1.3.2 SPLMWATH的分離與純化 將上述反應(yīng)后的溶液用 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices(10 K)在室溫下 4 000 r/min離心 20 min,丟棄超濾液,收集保留液。將保留液用 0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液透析,然后上預(yù)先用 0.01 mol/L pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液平衡好的 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,流速 0.5 ml/min,再用含 0.2 mol/L和 2 mol/L NaCl的 0.01 mol/L pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液分步洗脫,流速0.5ml/min,收集第二個(gè)蛋白質(zhì)峰,最后將收集的洗脫液用 0.02 mol/L pH 7.3的 PBS透析,即獲得純化的 SPLMWATH溶液,4℃中保存?zhèn)溆肹2]。

1.3.3 SPLMWATH涂覆 PEI-G結(jié)合 PVC管道將 SPLMWATH溶液注入 PEI-G結(jié)合 PVC管道,37℃中水浴 30 min后倒出剩余溶液,真空常溫下干燥備用[4]。

1.4 肝素涂層 PVC管道的制備 配制 500 U/Ml的肝素鈉水溶液 100m l,硫酸滴定 pH=1;再將其注入 PEI-G結(jié)合 PVC管道,37℃中水浴 30 min后倒出剩余溶液,真空常溫下干燥備用[4]。

1.5 低分子肝素涂層 PVC管道的制備 配制 500 IU/ml的低分子肝素鈉水溶液 100 Ml,硫酸滴定 pH=1;再將其注入 PEI-G結(jié)合 PVC管道,37℃中水浴 30 min后倒出剩余溶液,真空常溫下干燥備用[4]。

1.6 Chand lar loop模型體外評(píng)價(jià)各組管道的生物相容性

1.6.1 Chandlar loop模型的建立 將 PVC管道分為無(wú)涂層組(A組),肝素涂層組(B組),低分子肝素涂層組(C組),SPLMWATH涂層組(D組)。向各組管道內(nèi)分別注入 3 ml同一來(lái)源肝素抗凝新鮮全血,然后用連接頭使首尾相連而形成 Chandlar loop,放入 37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中水平旋轉(zhuǎn) 4 h,轉(zhuǎn)速為100 r/min,再將血液收集備用[6]。

1.6.2 血小板計(jì)數(shù)的測(cè)定 取 0.75 ml收集的血液,用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)。

1.6.3 纖維蛋白原含量、IL-8和 MCP-1濃度的測(cè)定 將 2ml收集的血液在 4℃下 12 000 r/Min離心 10 min,取血漿分別用全自動(dòng)血液分析儀和ELISA試劑盒測(cè)定纖維蛋白原含量和 IL-8、MCP-1的濃度。

1.6.4 掃描電鏡觀察 用去離子水反復(fù)清洗 PVC管道,常溫下自然晾干,切取管道內(nèi)表面制作電鏡標(biāo)本。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 13.0.統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 IL-8和 MCP-1的濃度測(cè)定 體外模擬轉(zhuǎn)流 4 h后,各組血漿 IL-8和 MCP-1的濃度均較基線(xiàn)值有所升高,其中 D組升高程度最小,與 B組和C組兩組間有顯著性差異(P＜0.05),而 B組和 C組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 各組管道引起血漿 IL-8濃度變化的比較

圖2 各組管道引起血漿 MCP-1濃度變化的比較

2.2 血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量測(cè)定 體外模擬轉(zhuǎn)流 4 h后,各組血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量均較基線(xiàn)值有所下降,其中 D組下降程度最小,與 B組和 C組兩組間有顯著性差異(P＜0.05),且 B組和 C組之間也有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量比較(n=6,±s)

表1 各組血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量比較(n=6,±s)

注:與 D組比較*P＜0.05;與 C組比較#P＜0.05

基線(xiàn)值 198±22 2.75±0.56 A組 84±14 0.99±0.25 B組 109±19*# 1.50±0.35*#C組 150±17* 1.95±0.33*D組 174±20 2.55±0.55

2.3 電鏡結(jié)果 掃描電鏡觀察結(jié)果顯示各組管道內(nèi)表面均有不同程度的血小板和纖維蛋白粘附:A組管道表面可見(jiàn)大量血小板和纖維蛋白沉著,大小不均,相互粘連,呈團(tuán)塊狀;而 B組、C組和 D組管道表面血小板和纖維蛋白沉著數(shù)目較少,且較為分散,其中 D組管道的表面情況明顯優(yōu)于 B組和 C組,C組略?xún)?yōu)于 B組。見(jiàn)圖3。

圖3 各組管道內(nèi)表面的掃描電鏡照片(×200)

3 討 論

血液與 PVC材料表面接觸可以引起多種促炎細(xì)胞因子的生成和釋放,IL-8和 MCP-1就是其中兩種重要的趨化因子。它們可以通過(guò)趨化和活化白細(xì)胞而參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和抗感染防御機(jī)制[7],且其生成和釋放具有不同程度的補(bǔ)體依賴(lài)性[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外模擬轉(zhuǎn)流 4 h后,各組血漿 IL-8和MCP-1的濃度均較基線(xiàn)值有所升高,其中 D組升高程度最小,與 B組和 C組間有顯著性差異(P＜0.05),表明D組管道能夠較 B組和C組管道更好的抑制血漿 IL-8和 MCP-1的生成和釋放,其原因可能與 SPLMWATH的特性有關(guān)。研究表明肝素對(duì)血漿蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞的吸附性與其多糖鏈的長(zhǎng)短呈正相關(guān)[8]。由于肝素鏈只占 SPLMWATH組分的很小一部分,所以 SPLMWATH涂層對(duì)血漿蛋白的非特異吸附性較肝素涂層和低分子肝素涂層弱,其引起的補(bǔ)體替代途徑激活就少,進(jìn)而減少 IL-8和 MCP-1的生成和釋放。另外,B組和 C組兩組間的 IL-8和 MCP-1濃度變化無(wú)顯著性差異(P＞0.05),主要考慮可能是由于肝素涂層和低分子肝素涂層的總肝素鏈長(zhǎng)度相當(dāng)所致。

血液與 PVC材料表面接觸首先引起血漿蛋白的吸附,進(jìn)而導(dǎo)致接觸系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)激活及血小板的粘附、聚集和活化[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,體外模擬轉(zhuǎn)流 4 h后,各組血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量均較基線(xiàn)值有所下降,其中 D組下降程度最小,與 B組和 C組兩組間有顯著性差異(P＜0.05),這可能仍然與 SPLMWATH的低血漿蛋白吸附性和強(qiáng)大的抗凝血活性有關(guān)。由于 SPLMWATH涂層 PVC管道表面吸附的纖維蛋白原和凝血酶活化的纖維蛋白較肝素涂層和低分子肝素涂層 PVC管道表面少,從而粘附、聚集于纖維蛋白的血小板也較少,所以?huà)呙桦婄R觀察結(jié)果可見(jiàn) D組管道表面血小板和纖維蛋白沉著數(shù)目較少,且較為分散,明顯優(yōu)于 B組和 C組。另外,由于低分子肝素涂層的抗凝血活性?xún)?yōu)于肝素涂層,故 B組和 C組兩組間的血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量也有顯著性差異(P＜0.05),C組管道表面情況略?xún)?yōu)于 B組。

綜上所述,各種涂層處理過(guò)的 PVC管道均減少了血液相關(guān)成分的激活和消耗,而 SPLMWATH涂層 PVC管道具有較肝素涂層和低分子肝素涂層管道更佳的生物相容性,減輕了血液與 PVC管道表面接觸所引起的炎性介質(zhì)生成、釋放和凝血系統(tǒng)激活,提示 SPLMWATH可作為一種新型的、更佳的生物活性物質(zhì)而應(yīng)用于體外循環(huán)管道的表面改性。

[1]Belway D,Rubens FD.Currently available biomaterials for use in cardiopulmonary bypass[J].Expert Rev Med Devices,2006,3(3):345-355.

[2]Chan A,Berry L,O'Brodovich H,et al.Covalentantithrombin-heparin complexes with high anticoagulant activity.Intravenous,subcutaneous,and intratrachealadministration[J].JBiol Chem,1997,272(35):22111-22117.

[3]Klement P,Du Y j,Berry L,et al.Blood-compatible biomaterialsby surface coating with anovel antithrombin-heparin covalent complex[J].Biomaterials,2002,23(2):527-535.

[4]楊劍,易定華,劉金成,等.肝素涂層體外循環(huán)管道的制備及生物學(xué)性能評(píng)價(jià)[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào),2004,23(2):169-174..

[5]Chuang TW,Lin DT,Lin FH.Immobilization of NaIO4-treated heparin on PEG-modified 316L SSsurface for high antithrombin-III binding[J].JBiomed Mater Res A,2008,86(3):648-661.

[6]Lappegard KT,Fung M,Bergseth G,et al.Artificial surfaceinduced cytokine synthesis:effect of heparin coating and complement inhibition[J].Ann Thorac Surg,2004,78(1):38-44,44-45.

[7]Levy JH,Tanaka KA.Inflammatory response to cardiopulmonarybypass[J].Ann Thorac Surg,2003,75(2):S715-S720.

[8]Chan AK,Paredes N,Thong B,et al.Binding of heparin to plasma proteinsand endothelial surfaces is inhibited by covalent linkage to antithrombin[J].Thromb Haemost,2004,91(5):1009-1018.

[9]Li S,PriceR,Phiroz D,etal.System ic inflammatory response during cardiopulmonary bypassand strategies[J].JExtra Corpor Technol,2005,37(2):180-188.