重組血紅蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定＊

楊海波,廖春麗,朱 濤,王蓮哲,陳蘭英

(河南城建學(xué)院生物工程系,平頂山467044)

重組血紅蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定＊

楊海波,廖春麗,朱 濤,王蓮哲,陳蘭英△

(河南城建學(xué)院生物工程系,平頂山467044)

目的 利用大腸桿菌表達(dá)載體,表達(dá)血紅蛋白(Hb)基因,并進(jìn)行純化及鑒定。方法 將原核表達(dá)載體p HE 2-Hb轉(zhuǎn)化入 E.Coli JM109,經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá);應(yīng)用陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析分級(jí)純化目的蛋白,用Western blot鑒定純化出的目的蛋白。結(jié)果 SDS-PAGE分析表明,表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量約為67 kD,與理論值相一致;應(yīng)用陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析分級(jí)純化目的蛋白,Western blot檢測(cè)表明得到純度較高的目的蛋白。結(jié)論 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),獲得了較高純度的目的蛋白,為進(jìn)一步研究 Hb的生物傳氧機(jī)制研究和以 Hb為基礎(chǔ)載氧藥物的研究提供重要基礎(chǔ)和研究依據(jù),并將為血液替代品和相關(guān)疾病的治療研究奠定研究基礎(chǔ)。

血紅蛋白;原核表達(dá);純化

血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是存在于紅細(xì)胞中的一種重要血紅素蛋白質(zhì)。血紅蛋白分子由4個(gè)亞基組成,其中兩個(gè)為α多肽鏈,另兩個(gè)為β多肽鏈,每個(gè)多肽鏈都含有一個(gè)血紅素亞基 heme,每個(gè) heme都有一個(gè)氧結(jié)合部位。其主要功能是攜帶氧到組織細(xì)胞內(nèi)和清除組織細(xì)胞內(nèi)CO2,維持血液酸堿平衡。對(duì)于血紅蛋白的研究工作受到國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究者的重視,已成為國(guó)際生物醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點(diǎn)[1-2]。作者通過原核表達(dá)、純化及鑒定,從而為進(jìn)一步研究血紅蛋白的生物傳氧機(jī)制研究和以 Hb為基礎(chǔ)載氧藥物的研究提供重要基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 表達(dá)載體p HE2-Hb為本系實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌工程菌株為大腸桿菌JM109,為本系實(shí)驗(yàn)室保存菌株。QIAquick Gel Extraction Kit購(gòu)自Qiagen公司。氨芐青霉素、DTT、IPTG、丙烯酰胺、N,N甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)均購(gòu)自華美生物工程公司。Q Sepharose FF和SP Sepharose FF交換柱購(gòu)自 GE公司。

1.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將含重組質(zhì)粒p HE 2-Hb的單個(gè)菌落接種于1 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的 TB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)至飽和。按1∶20接種量接種飽和培養(yǎng)物到4 mL LB培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)約2 h至OD 600約等于0.6。留下誘導(dǎo)前對(duì)照樣本后,加入 IPTG至終濃度為0.2 mmoL/L,并同時(shí)加入 Hemin至終濃度為25μg/mL,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后再次加入 Hemin至終濃度為50μg/mL,培養(yǎng)6 h后收菌,以2×凝膠加樣緩沖液50μL懸浮,煮沸10min,離心后取10μL上清液進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。

1.3 蛋白純化

1.3.1 陰離子交換層析 將收集的菌體破碎后,12 000×g離心30min后,收集上清液并在透析緩沖液中(20 mM Tris-HCl,p H 8.3)透析過夜。將透析后的樣品高速離心后進(jìn)行Q Sepharose FF陰離子交換柱的離子交換吸附。上樣后,交換柱由20 mM Tris·HCl溶液(p H 8.3)平衡3～5個(gè)柱體積,洗脫至沒有基線水平,然后用20 mM Tris·HCl溶液(1 M NaCl,0.2 mM TETA,p H 7.15)梯度洗脫,梯度長(zhǎng)度為100 mL,流出液相對(duì)洗脫液的鹽濃度從0增加到100%,流速為1 mL/min,分管收集目標(biāo)峰,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.3.2 陽(yáng)離子交換層析 合并目標(biāo)蛋白,將上述目標(biāo)蛋白進(jìn)行SP Sepharose FF陽(yáng)離子交換柱的離子交換吸附。交換柱由0.05 mol/L Tris·HCl溶液(含0.1 mol/L尿素,p H 7.2)平衡3～5個(gè)柱體積,上樣,洗脫至沒有蛋白流出,然后用0.05 mol/L Tris·HCl溶液(含0.1 mol/L尿素 +4 mol/L NaCl,p H 7.2)梯度洗脫,梯度長(zhǎng)度為100 mL,流出液相對(duì)洗脫液的鹽濃度從0增加到100%,流速為5 mL/min,收集目標(biāo)峰,把目標(biāo)峰過Sephadex G225脫鹽柱脫鹽,濃縮,凍干。

1.4 Western blot檢測(cè) 蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,取出凝膠,用 PBS漂洗 3次,每次 5min。室溫平衡 30min。用半干法轉(zhuǎn)膜,PBS漂洗2次,每次5min。以5%脫脂奶粉室溫封閉l h。PBS漂洗3次,每次5min。一抗溫室孵育l h。PBST漂洗 4次,每次 5min。二抗溫室孵育 l h。用PBST漂洗4次,每次5min。顯影、定影并掃描。

2 結(jié) 果

2.1 Hb的原核表達(dá) 用 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),含 PHE2-Hb質(zhì)粒的重組菌誘導(dǎo)后在蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約15 kD處有明顯特異性蛋白條帶,與預(yù)期大小一致,而空載體菌和未誘導(dǎo)菌均無此特異性表達(dá)條帶,并同時(shí)可以看到共表達(dá)的MAP的特異性條帶,位于30 kD左右,見圖1。.

圖1 p HE 2-Hb重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 重組血紅蛋白的陰離子交換層析圖

2.2 Hb的分離純化 收集的培養(yǎng)菌用裂解緩沖液重懸后,經(jīng)超聲波破碎,4℃,12 000 r/min離心40min,取上清液,利用FPLC系統(tǒng)和陰離子交換層析分離出粗蛋白,在分離過程中可以看到層析柱洗脫的過程中有明顯的變紅現(xiàn)象。層析圖如圖2所示,在洗脫過程中出現(xiàn)了3個(gè)洗脫峰,分別收集進(jìn)行SDSPAGE檢驗(yàn),見圖3。SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果顯示,目標(biāo)蛋白所在位置為洗脫峰3,濃度較高,但是出現(xiàn)了雜帶,收集的洗脫峰3溶液顯示明顯的紅色。

圖3 陰離子交換層析收集樣品的SDS-PAGE檢測(cè)

圖4 重組血紅蛋白的陽(yáng)離子交換層析圖

圖5 陽(yáng)離子交換層析收集樣品的SDS-PAGE檢測(cè)。

圖6 誘導(dǎo)表達(dá)后的重組 Hb的Western blotting分析

合并洗脫峰3的樣品,透析過夜后通過陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行第2次純化,直接上樣,上樣前必須用緩沖液平衡色譜柱,層析圖如圖4所示,出現(xiàn)了2個(gè)主峰和4個(gè)小峰。SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果顯示,每個(gè)峰洗脫的樣品都為同一樣品,而且樣品純度達(dá)到所需要求,見圖5。

2.3 Hb的鑒定 Western blott檢測(cè)結(jié)果顯示,在37℃條件下,對(duì)照組未經(jīng)IPTG誘導(dǎo),則未出現(xiàn) Hb蛋白的表達(dá)。而經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)處理之后,則有不同程度的蛋白表達(dá)效果,0.3 mM IPTG誘導(dǎo)時(shí),Hb蛋白表達(dá)量較高,隨著濃度的增加,0.5 mM IPTG和0.7 mM IPTG誘導(dǎo)時(shí) Hb表達(dá)量較0.3 mM IPTG誘導(dǎo)時(shí) Hb表達(dá)量略為降低,見圖6。

3 討 論

重組 Hb的設(shè)計(jì)和純化制備過程是尋求血液替代品,獲得Hb制品的重要手段和重要基礎(chǔ)。目前人類 Hb制品基本上分為3類,即化學(xué)修飾 Hb、含酶類的人工紅細(xì)胞和微包囊 Hb、分子遺傳工程重組 Hb。隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,克隆技術(shù)的進(jìn)步深刻影響著人工血液的研究工作,可以借助基因工程手段將rHb經(jīng)微生物大量繁殖并純化來大批量生產(chǎn)人 Hb。作為血液替代品,因基因工程可以避免化學(xué)修飾、微囊包被 Hb的盲目性和試探性,所以展示出更實(shí)用的前景。由于Hb具有高效的載氧能力和維持膠體滲透壓的功能,目前國(guó)內(nèi)外都致力于研制以 Hb為基質(zhì)的攜氧劑作為紅細(xì)胞代用品研究開發(fā)的主攻方向。rHb已成為人造血液研究的最新前沿工程和熱點(diǎn)領(lǐng)域[3-4]。

Hb具有生物傳氧功能,因此以 Hb為基礎(chǔ)的載氧藥物研究一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一,該研究可以較好地解決多種疾病如缺血性心腦血管病的供氧問題[5-6]。因此,對(duì)載氧藥物原料Hb的要求將會(huì)越來越高,需要探索更為高效、合理的Hb純化方法。本文采用Q Sepharose FF陰離子交換柱和SP Sepharose FF陽(yáng)離子交換柱的離子交換吸附進(jìn)行分離純化,得到純度較高的重組蛋白。

Hb的成功表達(dá)和純化為進(jìn)一步將更好地了解 Hb的生物傳氧機(jī)制研究和以Hb為基礎(chǔ)載氧藥物的研究提供了重要基礎(chǔ)和研究依據(jù),并將為血液替代品和相關(guān)疾病的治療研究奠定研究基礎(chǔ)。

[1]Chang TMS.Blood substitutes:Principles,methods,products and clinical trials[J].Clin Chem,1998,44:2229.

[2]Abdu l,Alayash.Oxygen therapeutics:Can we tame heamoglobin[J]Nature Rev,2004,3:152.

[3]Winslow RM.Artifieialblood:Aneientdream,modemeniglna[J].Nature Bioteehnol,1998,16:621.

[4]高林,張文博,胡永祥,等.紅細(xì)胞代用品的臨床研究進(jìn)展[J].中國(guó)輸血雜志,2004,17(6):486.

[5]Chang TMS.Oxygen carriers[J].Curr Opin Investig Drugs,2002,3:1187.

[6]Robert M,Winslow RM.Blood Substitutes[J].Adv Drug Deliv Rev,1999,40(2000):131

Prokaryotic expression,purification and identification of recombinant hemoglobin＊

YANG Hai-bo,LIAO Chun-li,ZHU Tao,et al.
(Department of Biologic Engineering,Henan University of Urban Construction,Pingdingshan,Henan467044,China)

Objective To construct a prokaryotic expression vector for the expression of hemoglobin to purify and identity.Methods Prokaryotic expression vector p HE 2-Hb was expressed in E.Coli JM109.The expressed protein was identified by SDSPAGE analysis.The target protein was cation-exchange chromatography and anion-exchange chromatography.Results The SDSPAGE showed that the relative molecular mass of this protein was consistent with the predicted value.The protein was expressed in E.Coli JM109 after the prokaryotic expression vector p HE 2-Hb successfully constructed,and the size of the protein was 67 kD,which was consistent with the theoretical data.Conclusion The successfully constructed prokaryotic expression vector p HE 2-Hb,and the purified Hb protein can not only provide an important foundation to the study of more about the oxygen transfer mechanism of Hb,and Hb-based oxygen-carrying drugs,but also provide research proofs to the blood substitutes and the treatment of related diseases.

hemoglobin;prokaryotic expression;purification

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.21.016

R331.141;R446.1

A

1671-8348(2010)21-2889-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30470877);河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102310006)。△

,E-mail:lychen666@163.com

2010-06-28

2010-08-17)