嵌頓痔患者外周血Th1/Th2檢測分析

1 一般資料與方法

1.1 對象 本組共32例，其中，男18例，女14例，年齡20～60歲。全部為混合痔嵌頓患者。32例均行手術治療，分別于術前、術后2周抽靜脈血5ml肝素鈉抗凝。

1.2 檢測目的 應用流式細胞儀檢測外周靜脈血中細胞表面分子標記為CD3+和CD8-的T淋巴細胞中的IL-4 和IFN-γ含量，從而判斷外周血中的Th1、Th2漂移現(xiàn)象。

1.3 檢測方法 主要儀器：流式細胞儀Epics XL·MCL，美國BECKMAN COULTER公司，低溫高速離心機Contifuge Stratos，德國Heraeus公司，旋渦混合器XW－80A江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

試劑：PMA、Ionomycin、Monensin美國Sigma公司出品，抗體和破膜劑。以下均為法國Immunotech公司出品：細胞表面標記抗體：CD3-Pc5，CD8-FITC；細胞內因子抗體：IL-4-PE，IFN-γ-PE；同型對照：Rat IgG1-PE(對應于IL-4-PE)，Mouse IgG1-PE(對應于IFN-γ-PE)；破膜劑：IntraPrep破膜劑。

1.4 實驗方法 晨起空腹血5ml用肝素納抗凝。取一只試管，加入200μl血液和200μlRPMI1630。加入10μlPMA工作液＋8μl50μg/ml Ionomycin工作液＋6.8μl 0.1mg/mlMonensin工作液，混勻。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱4～6小時。取出混勻，加入20μlCD3-PC5和20ulCD8-FITC，室溫避光孵育15分鐘。分成4管，每管加入100μl已染色的全血，編號為A1,A2,A3,A3。每管中加入100μl IntraPrep中的Reagebt A（固定液），室溫，避光孵育15分鐘。每管中再加入3mlPBS，1500rpm離心5分鐘，棄除上清。再每管中加入100μlIntraPrep中的Reagent B（破膜和溶血液），同時各管中按附表1加入相應的抗體各10μl，室溫，避光孵育15分鐘。每管中加入3mlPBS，1500rpm離心5分鐘，棄除上清。取0.5ml PBS重懸細胞，上機檢測。

2 結果

手術前后的外周血單個核細胞經(jīng)PAM誘導后CD3+/CD8-/IFN-γ+和CD3+/CD8-/IL-4+流式細胞分析結果。見附表。

經(jīng)Excel平均值的成對雙樣本分析，對各組數(shù)據(jù)進行兩兩檢驗。手術前與手術后各組數(shù)據(jù)比較均有非常顯著性差異（P＜0.001），手術前組患者的CD3+IL-4+含量高于手術前組的CD3+IFN-γ+（P＜0.05），手術前組患者的CD8+IL-4+含量也高于手術前組的CD8+IFN-γ+（P＜0.05），而手術后各組數(shù)據(jù)比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。

附表1 試管抗體對照

附表2 各組PBMC中CD3+/CD8-lL-4+和CD3+/CD8-lFN-γ+的含量（ng/l）比較 （）

附表2 各組PBMC中CD3+/CD8-lL-4+和CD3+/CD8-lFN-γ+的含量（ng/l）比較 （）

3 討論

關于痔瘡病因的解釋，目前大都只停留在解剖學的層面上。

臨床發(fā)現(xiàn)，各期的痔瘡病人，都有靜止期和發(fā)作期。只有發(fā)作期的病人會有出血或疼痛出現(xiàn)。發(fā)作期的痔瘡表現(xiàn)為充血水腫、血栓形成，呈現(xiàn)急性炎癥反應，但細菌感染的跡象不明顯，極少出現(xiàn)化膿性結局。

痔瘡發(fā)作常常有“情志”方面的病因，如情緒激動特別是大怒，痔瘡出現(xiàn)的炎癥反應無法完全用局部“括約肌痙攣”等單一因素解釋。全身性因素應該在痔瘡發(fā)作的過程中扮演重要角色。

人體各個部位的炎癥反應，都與免疫反應有關。免疫反應不外乎體液免疫和細胞免疫。輔助T細胞Th1/Th2功能上的劃分大大提高了人們對免疫反應極化的認識。近年的研究揭示，體內的T輔助細胞（嚴格意義上是Th0細胞）在各種生理與病理條件下可分化為Th1和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-α和IFN-γ，最特異分泌的細胞因子是IFN-γ+，Th2細胞則主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,最特異分泌的細胞因子IL4 +，IL-4和IFN-γ?；ハ嗯懦?。Th1細胞是細胞毒性T細胞，活化I型免疫效應在抗病毒感染和細胞內細菌感染的免疫應答中發(fā)揮作用。而Th2細胞活化II型免疫反應與感染的持續(xù)進展和慢性化有關，對微生物感染具有負反饋調節(jié)作用。Th1細胞可抑制Th2細胞的作用，反之亦然，外源性IL-4可使T前體細胞向Th2細胞分化，而IFN-γ則可抑制其向Th2細胞分化。

本文檢測表明，嵌頓痔病人發(fā)病時血中T細胞免疫系統(tǒng)被激活，外周血中Th2細胞占優(yōu)勢，Th2型反應模式處于優(yōu)勢狀態(tài)。推測嵌頓痔的發(fā)病是在 Th2優(yōu)勢反應模式狀態(tài)下，出現(xiàn)的血管擴張明顯、血管通透性顯著增強等。這種血流變學動態(tài)變化使白細胞外滲閾值明顯降低。這樣的結果首先是出現(xiàn)水腫，繼而是疼痛和括約肌痙攣，導致靜脈淋巴的回流受阻，從而引發(fā)更嚴重的水腫及血管破裂出血、血栓形成。

然而，由于體內細胞因子的網(wǎng)絡調節(jié)系統(tǒng)非常復雜，不同的細胞因子可以產(chǎn)生相同的作用，而同一個細胞因子在不同的細胞和不同條件下亦能產(chǎn)生相反作用。只測定一種細胞因子或研究一個環(huán)節(jié)，而推測整個過程或整個網(wǎng)絡作用的結論，很可能會出現(xiàn)偏差。因此，對于Th1和Th2細胞免疫功能對血栓性痔的影響，必須充分認識細胞因子作用的多樣性和復雜性，全面分析和綜合考慮。