高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物組織中喹乙醇標(biāo)示殘留物

張小軍，鄭 斌*，陳雪昌，余海霞，梅光明

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316100；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035；3.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316000；4.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316000)

高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物組織中喹乙醇標(biāo)示殘留物

張小軍1,2，鄭 斌3,*，陳雪昌1，余海霞4，梅光明1

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316100；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035；3.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316000；4.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316000)

建立動(dòng)物組織中喹乙醇標(biāo)示殘留物3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的高效液相色譜測(cè)定方法。肌肉組織通過(guò)鹽酸水解提取MQCA，陰離子固相萃取柱凈化，高效液相色譜定量。方法在4.0～200μg/kg添加范圍內(nèi)的平均回收率為82.1%～90.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%，方法定量限為4.0μg/kg。

高效液相色譜；喹乙醇標(biāo)示殘留物；3-甲基喹噁啉-2-羧酸

喹乙醇屬于喹噁啉類化合物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常作為一種較好的生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加于飼料中。喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)能夠在短時(shí)間內(nèi)代謝，其10多種代謝產(chǎn)物中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是主要代謝物，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，是歐盟規(guī)定的標(biāo)示殘留物。喹乙醇及其代謝物有致癌、至畸變作用，食用含有該類藥物殘留的肉類產(chǎn)品會(huì)對(duì)人體造成危害[1]。

目前動(dòng)物食品中常用的MQCA檢測(cè)方法有液相色譜法[2-4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、納米膠體金探針?lè)╗7]等。納米膠體金探針?lè)ú荒軌驕?zhǔn)確定量，液質(zhì)聯(lián)用法由于儀器昂貴而不能夠普及，影響檢測(cè)方法推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用酸水解前處理和固相萃取等方法，研究并建立適用于動(dòng)物食品中MQCA測(cè)定的高效液相色譜方法，為喹乙醇及其代謝物的檢測(cè)及監(jiān)控提供一種提取凈化效果好、靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、對(duì)蝦和草魚(yú)購(gòu)自舟山東河市場(chǎng)，用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻。

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備高純水；甲醇、甲酸、乙酸乙酯(均為色譜純) MERK公司；鹽酸(分析純) 中國(guó)上海試劑總廠；3-甲基喹噁啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%) 德國(guó)Dr公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance 2695高效液相色譜儀(帶紫外檢測(cè)器)、60mg/3mL MAX陰離子交換固相萃取柱 美國(guó)Waters公司；T18勻漿機(jī)、MS2漩渦混合器 德國(guó)IKA公司；Centrifuge5810高速離心機(jī) Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹儀 Organomation公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器江蘇億通電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取(5±0.02)g樣品置于50mL離心管中，加入15mL 2mol/L鹽酸，勻漿5min，蓋塞振蕩水解60min，然后8000r/min離心10min，收集上清液，備用。

1.3.2 凈化

MAX固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，待溶液流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速小于3mL/min，待樣液全部流出后用3mL乙酸鈉溶液-甲醇(0.05mol/L乙酸鈉溶液:甲醇=9:1，V/V)淋洗固相萃取柱，待全部流出后抽真空5min。最后用3mL甲酸-乙酸乙酯溶液(甲酸:乙酸乙酯=2:98，V/V)洗脫，洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈?，?mL流動(dòng)相溶液溶解殘?jiān)?，漩渦混勻，過(guò)0.45μm濾膜后待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Sunfire C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。流動(dòng)相：甲醇-1.0%甲酸溶液(40:60，V/V)。流速：1.0mL/min。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：50μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度100mg/L。避光冷藏保存，保存期為3個(gè)月。

MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成20、50、250、500、1000μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測(cè)定

分別取系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積定量。分別取豬肉、牛肉、對(duì)蝦和草魚(yú)樣品各5.0g，加入相當(dāng)于樣品含量4、40、200μg/kg的MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行，測(cè)定MQCA含量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法選擇

MQCA殘留在動(dòng)物組織中與肌肉結(jié)合緊密，普通方法很難將其完全提取，且會(huì)帶入大量色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，影響分離、提取效果。有研究表明可以利用酸水解[7]、堿水解[8]和酶解[4,9]等方法使MQCA與肌肉組織分離，形成游離態(tài)的MQCA，達(dá)到提取的目的。堿水解通常反應(yīng)較為劇烈，會(huì)造成少量MQCA降解，且反應(yīng)后需要調(diào)節(jié)pH值至酸性。酶解條件比較溫和，但需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(16h以上)。本研究采用鹽酸水解方法，研究不同濃度鹽酸的酸解效果。采用陽(yáng)性草魚(yú)樣品進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，以實(shí)測(cè)最高濃度為理論濃度計(jì)算獲得鹽酸水解效果圖，其結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，樣品組織用2mol/L鹽酸溶液水解60min，可有效將MQCA從肌肉組織中分離。方法與同等實(shí)驗(yàn)條件氫氧化鈉堿水解相比，鹽酸水解條件較為溫和，可減少提取液中雜質(zhì)成分，提高凈化效果，提高方法回收率。

圖1 鹽酸濃度對(duì)樣品水解的影響Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration on hydrolysis efficiency

2.2 色譜條件選擇

圖2 50μg/L MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of MQCA standard (50μg/L)

實(shí)驗(yàn)對(duì)ZORBAX SB-C18柱(250mm×4.6mm，5μ m)、Sunfire(250mm×4.6mm，5μm)、X-Bridge(250mm×4.6mm，5μm) 3種C18色譜柱進(jìn)行選擇，ZORBAX和XBridge出峰較早，但有雜峰干擾，Sunfire出峰相對(duì)較晚，但分離效果好，因此選擇Sunfire柱作為MQCA分析柱。分析MQCA常用的流動(dòng)相為1%甲酸溶液-甲醇(60:40)，甲醇、水和乙酸-乙酸鈉緩沖液組成梯度洗脫以及0.5%甲酸水溶液-甲醇(70:30)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，以1%甲酸溶液-甲醇(60:40)作為流動(dòng)相，其峰形和靈敏度最好。MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖如圖2所示，豬肉樣品空白色譜圖、樣品加標(biāo)色譜圖如圖3～5所示。MQCA色譜峰峰形尖銳，對(duì)稱性好，與雜質(zhì)完全分離，可滿足定量分析的要求。

圖3 豬肉空白樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of blank pork sample

圖4 豬肉樣品4μg/kg MQCA加標(biāo)色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of pork sample with spiked MQCA(4μg/kg)

圖5 豬肉樣品40μg/kg MQCA加標(biāo)色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of pork sample with spiked MQCA(40μg/kg)

2.3 線性范圍和檢出限

用MQCA標(biāo)準(zhǔn)使用液配制質(zhì)量濃度分別為20、50、250、500、1000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=105000X－272。方法在4.0～200μg/L范圍內(nèi)方法線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9994。將加標(biāo)濃度逐級(jí)稀釋添加于樣品中測(cè)定信噪比，最終按照10倍信噪比計(jì)算該方法的定量限(LOQ)為4.0μg/kg。

2.4 方法回收率和精密度

分別對(duì)豬肉、牛肉、對(duì)蝦和草魚(yú)樣品進(jìn)行3個(gè)梯度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。方法平均回收率為82.1%～90.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%。由結(jié)果可知，水產(chǎn)品MQCA的回收率要稍高于畜產(chǎn)品，其原因是由于水產(chǎn)品色素和脂肪含量相對(duì)較少，其基質(zhì)效應(yīng)要小于畜產(chǎn)品。

表1 樣品中添加回收率及方法的精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 1 Recovery rates and precision of the determination method(n=6)

2.5 樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)從舟山市場(chǎng)上購(gòu)得的豬肉、牛肉、草魚(yú)、對(duì)蝦各20個(gè)樣品進(jìn)行MQCA測(cè)定，沒(méi)有陽(yáng)性樣品檢出。結(jié)果表明該批次樣品沒(méi)有喹乙醇安全隱患，可利用本方法對(duì)市場(chǎng)繼續(xù)檢測(cè)監(jiān)控。

3 結(jié) 論

建立動(dòng)物組織中喹乙醇標(biāo)示殘留物MQCA的高效液相色譜測(cè)定方法，使用酸水解法提取組織中的MQCA，可有效地將MQCA從肌肉組織中分離；MAX固相萃取柱凈化能去除大量雜質(zhì)和色素，減少基質(zhì)效應(yīng)。利用方法對(duì)本地80個(gè)實(shí)樣進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性樣品。本方法具有重現(xiàn)性好、精密度高、抗雜質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)，可滿足目前的檢測(cè)要求。

[1] Commission Regulation (EC) No.2788/98 of 22 December 1998 amending Council Directive 70/524/EEC concerning additives in feedingstuffs as regards the withdrawal of authorisation for certain growth promoters[J].Off J Eur Commun, 1998, 347: 31-32.

[2] YUAN Zonghui, WU Yulian, WANG Yujie, et al. Development of an HPLC-UV method for simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and 3-methyl-quinoxiline-2-caboxylic acid in muscle and liver of swine, chicken and fish[J]. Journal of Veterinay Pharmacology and Therapeutics, 2006, 29: 142-143.

[3] WU Yujie, YU Huang, WANG Yulian, et al. Development of a highperformance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues[J]. Journal of Chromatography A,2007, 1146(1): 1-7.

[4] 殷居易, 倪梅林, 壽成杰, 等. 雞肉中喹乙醇、卡巴多及其代謝物的殘留檢測(cè)[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2006, 40(1): 11-15.

[5] BOISON J O, LEE S C, GEDIR R G. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 637: 128-134.

[6] HUTCHINSON M J, YOUNG P B, KENNEDY D G. Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatographyelectrospray, tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2005, 816: 15-20.

[7] YAMAGATA M, LOW L K. Automated and ultrasensitive detection of methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid by using gold nanoparticles probes SIA-rt-PCR[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24(9): 2858-2863.

[8] 王霄旸, 張麗芳, 薛飛群, 等. 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)鯽魚(yú)組織3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留量[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(8): 718-720.

[9] 歐陽(yáng)姍, 龐國(guó)芳, 謝麗琪, 等. 動(dòng)物組織中卡巴氧和喹乙醇以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2008,27(6): 590-594.

Determination of Olaquindox Marker Residue in Animal Tissues by HPLC

ZHANG Xiao-jun1,2，ZHENG Bin3,*，CHEN Xue-chang1，YU Hai-xia4，MEI Guang-ming1
(1. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316100, China； 2. College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China；3. Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316000, China；4. Zhoushan Ocean Research Institute, Zhejiang University, Zhoushan 316000, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed to determine olaquindox marker, methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA) residue in animal tissues. MQCA in muscle tissues were extracted by hydrochloric acid hydrolysis, purified by MAX SPE, and then quantitatively determined by HPLC. The recovery rate of spiked MQCA at the addition range of 4.0－200μg/kg was 82.1%－90.3% with the relative standard deviation (RSD) of less than 7%. The limit of detection (LOD) was 4.0 μg/kg.

high performance liquid chromatography (HPLC)；marker residue of olaquindox；methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA)

TS251.7

A

1002-6630(2010)24-0289-04

2010-04-22

浙江省分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008F70030)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009C32008)

張小軍(1982—)，男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全檢測(cè)。E-mail：xiaojun3627@163.com

鄭斌(1968—)，男，教授級(jí)高工，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全及標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：6369958@163.com