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    高效液相色譜法對羅漢果中VC含量的檢測

    2010-10-27 04:59:50寧德生梁小燕
    食品科學(xué) 2010年20期

    寧德生,梁小燕,方 宏

    (廣西壯族自治區(qū)、中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西 桂林 541006)

    高效液相色譜法對羅漢果中VC含量的檢測

    寧德生,梁小燕,方 宏

    (廣西壯族自治區(qū)、中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西 桂林 541006)

    目的:建立HPLC色譜法測定羅漢果中VC含量的方法。采用5g/L草酶對羅漢果浸提15min,對提取液中VC進(jìn)行檢測,具體方法:采用SinoChrom ODS-BP(250mm×4.6mm,5μm)分離;流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2,V/V);流速1.0mL/min;采用二極管陣列多波長檢測器確定VC的最大吸收波長為242nm;測定溫度25℃;進(jìn)樣量10μL。結(jié)果表明:VC溶液0.08~0.50mg/mL范圍線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r=1;回收率為99.3%,RSD為1.93%。結(jié)論:該方法操作簡便快速,精密度和穩(wěn)定性好,適用于羅漢果VC含量的測定。

    羅漢果;HPLC;VC

    羅漢果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C. Jeffrey)為葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬植物的成熟果實(shí),主產(chǎn)于廣西永福、臨桂和龍勝等地,是廣西著名特產(chǎn)。羅漢果性涼、味甘、無毒,有潤肺止咳、清熱解暑、涼血健胃、潤腸通便的功效,在治療咽喉炎、百日咳、急慢性氣管炎、胃腸疾病方面療效顯著[1-3]。羅漢果中除了含有一系列的三萜及三萜皂苷成分外[4],還含有豐富的VC[5]。

    目前,常用于測定VC的方法有2,6-二氯靛酚滴定法、碘滴定法、鉬藍(lán)比色法、紫外分光光度法、2,4-二硝基苯肼比色法、高效液相色譜法、熒光法以及電化學(xué)法等。這些方法都存在不同的局限性,如:2,4-二硝基苯肼比色法操作麻煩,耗時(shí)較長;碘滴定法和2,6-二氯靛酚法都易受到樣品提取液顏色的影響;含酸量較高樣品易造成紫外分光光度法測定的結(jié)果重復(fù)性較差等[6]。近年來,對羅漢果的開發(fā)與利用主要集中在將羅漢果中的甜苷開發(fā)成各種保健品、食品添加劑,而目前對于羅漢果中的VC綜合開發(fā)利用的不多,主要應(yīng)用于果飲業(yè)[7-8]。江新能等[9]報(bào)道采用碘酸鉀滴定法測定羅漢果中VC的含量,而采用高效液相色譜法對羅漢果中VC含量的分析目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立的羅漢果VC含量檢測的HPLC色譜法具有精密、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn),能夠應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的檢測,為開發(fā)羅漢果中豐富的VC,提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    成熟鮮羅漢果產(chǎn)自桂林桂北地區(qū)。

    甲醇(色譜純) 美國Tedia公司;磷酸、酒石酸、草酸(均為分析純) 西隴化工廠;VC對照品(純度大于99.7%) 湖南省南化化學(xué)品有限公司;超純水為自制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Agilent1100分析型高效液相色譜儀(包括二極管陣列多波長檢測器(DAD)、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、HP化學(xué)工作站) 美國Agilent公司;超純水儀 Millipore公司;pHtestr20防水型pH計(jì) 美國Eutech公司;多功能食品加工機(jī) 上海塞康電器有限公司;TDZ4A-WS低速臺式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:SinoChrom ODS-BP(250mm×4.6mm,5μm);柱溫25℃;檢測波長242nm;流速1.0mL/min;流動(dòng)相:體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2,V/V);進(jìn)樣量10μL。

    1.3.2 供試品溶液的制備

    稱取10.0g成熟鮮羅漢果,置于多功能食品加工機(jī)中,迅速加入100mL 5g/L草酸溶液(4℃)勻漿后浸提15min,減壓抽濾并用5g/L草酸溶液沖洗濾渣,濾液移至200mL的棕色容量瓶中,再用5g/L的草酸溶液定容,搖勻,取適量溶液經(jīng)0.45μm濾膜濾過,濾液作為供試溶液備用。

    1.3.3 對照品溶液的制備

    精密稱取50.0mg VC對照品,置于50mL棕色容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液溶解并定容至刻度,搖勻,避光冷藏。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件的選擇

    本實(shí)驗(yàn)在借鑒文獻(xiàn)[10-12]的基礎(chǔ)上,根據(jù)具體情況對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。利用DAD檢測器記錄對照品VC在190~400nm范圍內(nèi)的三維圖,確定VC在242nm的波長下有最大吸收。

    以甲醇-磷酸二氫鉀(以磷酸調(diào)到pH2.40、2.60和2.80)和甲醇-磷酸溶液(體積分?jǐn)?shù)0.1%、0.05%和0.01%)作為流動(dòng)相進(jìn)行考察,結(jié)果表明:兩種流動(dòng)相均可以對羅漢果中的VC實(shí)現(xiàn)分離,但對其中一些峰的分離及保留時(shí)間產(chǎn)生影響??紤]到流動(dòng)相中酸的含量過高以及緩沖鹽都會(huì)對柱子和泵產(chǎn)生不良影響,所以選用體積分?jǐn)?shù)0.05%的磷酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相。對于不同比例的甲醇不僅能改善峰形,還影響VC的出峰時(shí)間,考察體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(100:0、98:2、96:4、94:6、92:8,90:10,V/V)系統(tǒng)中不同比例的甲醇對VC分離情況的影響,結(jié)果表明:隨著甲醇比例增加,VC的保留時(shí)間不斷提前且造成其中一些峰重疊,但在體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇在98:2(V/V)配比下,分離度較好,VC色譜峰與前后兩個(gè)小峰達(dá)到基本分離(圖1),因此選用體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2,V/V)作為流動(dòng)相。

    圖1 羅漢果VC分離色譜圖Fig.1 HPLC separation of VC in Siraitia grosvenorii fruits

    2.2 樣品提取液的選擇

    VC的穩(wěn)定性除了受到光、熱、氧、金屬離子以及溶液pH值影響之外,還受到細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶和過氧化物酶的影響[13],因此在提取時(shí)盡量避光低溫以及選擇弱酸性的提取媒介。本實(shí)驗(yàn)在參考丁健樺等[14]和王翠琴等[15]對VC的穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上,選擇體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液、5g/L酒石酸溶液和5g/L草酸溶液作為提取液,按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行操作,考察VC的提取率及其穩(wěn)定性,結(jié)果表明:3種提取液對VC的提取率大致一樣,磷酸溶液稍高,酒石酸溶液其次;但酒石酸溶液、磷酸溶液作為提取液的穩(wěn)定性較差,VC的含量隨著時(shí)間呈線性遞減,而5g/L的草酸溶液能夠在5h 內(nèi)保持VC的含量基本不變(圖2)。所以選用5g/L草酸作為提取液。

    圖2 3種提取液對VC提取穩(wěn)定性的影響Fig.2 Screening for optimal solvent for sample extraction

    2.3 浸提時(shí)間的考察

    稱取10.0g的成熟鮮羅漢果,置于多功能食品加工機(jī)中,迅速加入200mL 5g/L草酸溶液(4℃)勻漿后,于0、5、10、15、20min取少量的提取液,4000r/min離心2min后取上清液過0.45μm濾膜,進(jìn)樣10μL,測定結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明:隨著浸提時(shí)間延長,提取液中的VC含量不斷增加,但增加的趨勢逐漸放緩,從15~20min VC的含量已無顯著變化,綜合考慮,確定浸提時(shí)間為15min。

    圖3 不同浸提時(shí)間對VC含量的影響Fig.3 Screening for optimal operating duration for sample extraction

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 線性關(guān)系與檢出限

    分別精密吸取對照品溶液2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL于25mL的容量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸緩沖液溶解并定容至刻度,按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析,進(jìn)樣體積為10μL,以對照品的峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X,mg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算(表1),回歸方程為:Y=31766X+153.62,r=1,質(zhì)量濃度在0.08~0.50mg/mL峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。信噪比RSN=3,測得VC檢測限為1.0ng。

    表1 線性關(guān)系Table 1 Preparation of VC standard curve

    2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

    取同一質(zhì)量濃度對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,進(jìn)樣10μL測得VC峰面積的RSD為0.21%。表明該儀器精密度良好。

    2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

    按1.3.2節(jié)操作處理樣品5份,分別進(jìn)樣10μL,測定VC峰面積的RSD為1.45%,表明該方法的重現(xiàn)性較好。

    2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    供試品溶液在制備后分別于0、2、4、8、12、24、48h進(jìn)樣10μL,測定VC峰面積的RSD為0.93%,羅漢果VC在48h內(nèi)損失率為2.44%,結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4.5 回收率實(shí)驗(yàn)

    由表2可知,VC的平均回收率為99.3%,RSD為1.93%,表明該方法具有較高的加標(biāo)回收率和精密度。

    表2 外標(biāo)法測定VC回收率結(jié)果(n=5)Table 2 Average spike recovery test for the developed method (n=5)

    2.5 不同產(chǎn)地的成熟鮮羅漢果VC的含量測定

    按1.3.2節(jié)方法對不同產(chǎn)地的成熟鮮羅漢果進(jìn)行處理,分析測定,結(jié)果見表3。結(jié)果表明:不同產(chǎn)地的羅漢果中VC的含量存在一定差異。

    表3 不同產(chǎn)地羅漢果中VC含量的測定Table 3 VC contents of Siraitia grosvenorii fruits from different growing areas determined by the developed method

    3 結(jié) 論

    3.1 本研究建立高效液相色譜法測定羅漢果中VC含量的方法,該方法操作簡便、精密度和穩(wěn)定性好,可以快速準(zhǔn)確地對羅漢果中VC進(jìn)行提取和定量分析;可以為羅漢果中VC的開發(fā)提供參考。

    3.2 本實(shí)驗(yàn)采用草酸溶液作為提取液,能夠較好地對羅漢果中的VC起到保護(hù)作用,減少VC的降解。

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    Determination of the Content of Vitamin C inSiraitia grosvenoriiFruits by HPLC

    NING De-sheng,LIANG Xiao-yan,F(xiàn)ANG Hong
    (Guangxi Institute of Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and China Academy of Sciences, Guilin 541006, China)

    Objective: To set up a HPLC method for the determination of the content of vitamin C in the fruits ofSiraitia grosvenorii. Methods: The chromatographic separation was achieved on SinoChrom ODS-BP (250 mm×4.6 mm, 5μm) held at 25 ℃ using a mixture composed of 0.05% H3PO4 and CH3OH (98:2,V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The diode array detector wavelength was set at 242 nm. The injection volume used was 10μL. Results: The developed calibration curve of vitamin C displayed good linearity over the concentration range from 0.08 to 5.0 mg/mL, with a correlation coefficient equaling 1. The average recovery of five replicates for vitamin C was 99.3% with 1.93% relative standard deviation (RSD).Conclusion: This method is simple, quick, precise and stable, and can used for determining the content of vitamin C in the fruits ofSiraitia grosvenorii.

    Siraitia grosvenorii;HPLC;VC

    Q946.6

    A

    1002-6630(2010)20-0311-03

    2010-01-03

    寧德生(1982—),男,研究實(shí)習(xí)員,學(xué)士,主要從事植物化學(xué)與藥學(xué)研究。E-mail:ndshgxib@sina.com

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