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    VC脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性測(cè)定

    2010-10-27 04:59:30楊水兵劉成梅劉瑋琳童桂鴻鄭會(huì)娟
    食品科學(xué) 2010年20期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂無水乙醇脂質(zhì)體

    楊水兵,劉成梅*,劉 偉,劉瑋琳,童桂鴻,章 瑜,鄭會(huì)娟

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    VC脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性測(cè)定

    楊水兵,劉成梅*,劉 偉,劉瑋琳,童桂鴻,章 瑜,鄭會(huì)娟

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    以卵磷脂和膽固醇為膜材,采用薄膜-超聲法制備VC脂質(zhì)體。通過單因素考察生產(chǎn)工藝對(duì)包封率的影響以及正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行工藝優(yōu)化。得出制備VC脂質(zhì)體最佳工藝:制備溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑(吐溫-80)=10:2,在此條件下包封率可達(dá)42.1%,平均粒度為373.9nm;將脂質(zhì)體在4℃下密閉放置15d,以脂質(zhì)體的粒徑變化為指標(biāo)考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明,脂質(zhì)體懸液粒徑無明顯變化,脂質(zhì)體懸液穩(wěn)定性良好。

    VC;脂質(zhì)體;薄膜水化法;包封率;穩(wěn)定性

    VC是一種水溶性的維生素,它可合成膠原蛋白和黏多糖,減少自由基對(duì)皮膚的損害,延緩衰老,還可抑制皮膚異常色素的沉積和酪氨酸酶的活性,減少黑色素的形成,被廣泛應(yīng)用在美白和抗氧化護(hù)膚化妝品中[1-2]。人體對(duì)VC的全部需要量都由食物供給,食物中的VC可迅速被胃腸道吸收。但在某些特殊情況下,如腹瀉、腸手術(shù)、養(yǎng)料吸收障礙、胃腸炎、消化道潰瘍等情況下會(huì)使VC的吸收減少。VC性質(zhì)不穩(wěn)定,在儲(chǔ)藏和加工過程中受熱、見光易氧化、分解,導(dǎo)致其利用率顯著降低[3-4]。VC是水溶性的,不易滲透到皮膚角質(zhì)層,故不能充分發(fā)揮效用。

    為減少維生素的損失,提高其在人體中的吸收利用率,本研究將VC包裹在脂質(zhì)體中,脂質(zhì)體不同于普通的膏霜基質(zhì),它的結(jié)構(gòu)類似生物膜,又稱人工生物膜,在水中平衡后具有親水性和疏水性兩性性質(zhì)。它是以生物相容的磷脂和膽固醇為載體,將藥物溶解或包裹于脂質(zhì)核,或是吸附、附著于納米粒表面的一種新型載藥系統(tǒng),具有緩釋、控釋、提高藥物穩(wěn)定性,增強(qiáng)療效降低毒副作用等方面的優(yōu)越性,同時(shí)在生物體內(nèi)及貯存過程中較穩(wěn)定[5-6]。

    脂質(zhì)體常用的制備方法有薄膜法[7]、超聲法[8]、乙醇注入法[9]、高壓乳勻法等[10]。薄膜法制備的脂質(zhì)體包封率較高,但一般粒徑較大。超聲法制備的脂質(zhì)體粒徑較小,但其包封率低,且不穩(wěn)定[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合脂質(zhì)體作為新型藥劑載體的優(yōu)越性,以大豆卵磷脂和膽固醇作為膜材,采用薄膜-超聲法制備包封率高、穩(wěn)定性好的VC脂質(zhì)體,為VC脂質(zhì)體的生產(chǎn)提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大豆磷脂(純度>92%) 北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司;膽固醇 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;VC、固藍(lán)B鹽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;吐溫-80 上海申字醫(yī)藥化工有限公司;EDTA 成都科龍化工試劑廠;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、冰乙酸天津市大茂化學(xué)試劑廠。

    1.2 儀器與設(shè)備

    RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHE-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器廠;KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Nicomp380 ZLS超細(xì)微粒粒度分析儀美國(guó)Santa barbara公司;漩渦混勻器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;T6紫外-可見分光光度計(jì) 普析通用儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 VC脂質(zhì)體的制備[12-13]

    稱取一定比例大豆磷脂、膽固醇,置于250mL梨型瓶中;加入無水乙醇溶解,將梨形瓶置于65℃水浴中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,待有機(jī)溶劑揮發(fā)完,形成脂質(zhì)干膜后,關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;加入含一定量VC及表面活性劑吐溫-80的PBS,在減壓的條件下旋轉(zhuǎn)洗膜15min,形成乳白色懸濁液;將乳白色懸濁液轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中,經(jīng)過超聲處理即形成均勻的白色脂質(zhì)體乳濁液。以包封率和粒徑為考察指標(biāo),篩選包封VC的最佳配方。

    1.3.2 脂質(zhì)體的粒徑測(cè)定[14-15]

    將脂質(zhì)體以緩沖液稀釋后,用激光納米粒度分析儀測(cè)定其粒徑及粒徑分布。測(cè)試角度90°,測(cè)試溫度為(25±0.1)℃,測(cè)試光波長(zhǎng)為632.8nm。

    1.3.3 脂質(zhì)體包封率測(cè)定

    1.3.3.1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    圖1 VC含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of vitamin C

    精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(相當(dāng)于抗壞血酸0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg),分別置于10mL比色管中。各加0.3mL EDTA溶液(0.25mol/L)、0.5mL乙酸溶液(0.5mol/L)、1.25mL固藍(lán)B鹽溶液(2g/L),加水稀釋至刻度,用漩渦混勻器混勻。室溫(20~25℃)下放置20min后,移入1cm比色皿內(nèi),以零管為參比,于波長(zhǎng)420nm處測(cè)量吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    由圖1可知,在測(cè)定范圍內(nèi),吸光度(y)與溶液中VC含量(x)滿足線性關(guān)系,y=0.0078x-0.0110,R2=0.9986,相關(guān)性很高。

    1.3.3.2 包封率測(cè)定(透析-分光光度法)

    取脂質(zhì)體懸浮液10mL置于已處理過的透析袋(cut off范圍12000~14000)中,封口,將其置于燒杯中,于室溫下透析10h。取出1mL透析內(nèi)液,測(cè)定波長(zhǎng)420nm處的吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出包封的VC含量,從而計(jì)算出VC的包封率[16]。

    式中:m包、m總分別表示包封于脂質(zhì)體的VC含量及總VC用量。

    1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

    分別以制備溫度、卵磷酯與膽固醇質(zhì)量比(卵膽比)、表面活性劑(吐溫-80)用量、無水乙醇用量、VC與總脂材比為因素,考察各因素對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響。1.3.4.2 正交試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑影響較大的4個(gè)因素(VC含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量),進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 最佳制備溫度的確定

    圖2 制備溫度對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on encapsulation efficiency and particle size

    在VC質(zhì)量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10(即卵磷脂1.6g、膽固醇0.4g、無水乙醇64mL、表面活性劑0.6g和VC 0.2g)條件下,考察制備溫度50、55、60、65、70℃對(duì)包封率及粒徑的影響,結(jié)果見圖2。

    結(jié)合包封率和粒徑這兩個(gè)因素的變化,50~65℃之間包封率總體呈上升趨勢(shì),而大于65℃則開始下降,粒徑隨溫度升高而增大,于60℃達(dá)到最大,超過60℃開始減小。雖然65℃粒徑不是最小值,但是其與最小值較接近,而且包封率為最大,故取65℃為制備溫度。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)與介質(zhì)溫度有密切關(guān)系,當(dāng)升高溫度時(shí)脂質(zhì)體雙分子層中疏水鏈可從有序排列變?yōu)闊o序排列,從而引起脂質(zhì)膜物理性質(zhì)的一系列變化,膜由“膠晶”態(tài)變?yōu)椤耙壕А睉B(tài),其厚度減小、流動(dòng)性增加等,發(fā)生這種轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度稱為相變溫度。

    在相變溫度以下時(shí),膜結(jié)構(gòu)處于晶態(tài);在相變溫度以上時(shí),處于流體態(tài)和液晶態(tài)。當(dāng)發(fā)生相變時(shí),可有液態(tài)、液晶態(tài)和晶態(tài)共存,出現(xiàn)相分離現(xiàn)象,使膜的通透性增加,被包裹物滲漏,故膜的流動(dòng)性直接影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。除此之外,過高溫度會(huì)造成VC的損失,而過低溫度成膜時(shí)間長(zhǎng)且不均勻,故選取65℃為制備溫度。

    2.2 卵膽比對(duì)包封率、粒徑的影響

    在VC質(zhì)量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10和溫度65℃條件下,考察以卵磷脂:膽固醇為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1制備VC脂質(zhì)體,對(duì)其包封率、粒徑的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 卵膽比對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.3 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on encapsulation efficiency and particle size

    膽固醇對(duì)磷脂的相變具有雙向調(diào)節(jié)作用。在相變溫度以上時(shí),它能抑制磷脂分子中脂肪酰鏈的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化運(yùn)動(dòng),降低膜的流動(dòng)性;在相變溫度以下時(shí),膜脂處于晶態(tài)排列,它又可誘發(fā)脂肪酰鏈的歪扭構(gòu)象的產(chǎn)生,阻止晶態(tài)的出現(xiàn)。膽固醇分子中的羥基還可與磷脂分子中的羰基以氫鍵形成復(fù)合物。脂肪酰鏈自由運(yùn)動(dòng)的減少,引起膜的壓縮,面積減小,結(jié)合緊密,流動(dòng)性降低而使?jié)B透性降低。

    而在一定比例范圍內(nèi),膽固醇比例越大,包封率越高,因?yàn)槟懝檀急砻婊钚詣┳饔檬筗/O乳液能穩(wěn)定形成;但膽固醇比例過大時(shí),組成脂質(zhì)體的磷脂量太少,脂質(zhì)體膜形成困難,而且不牢固,且由此形成的脂質(zhì)體膜親水性太強(qiáng),膜也容易破壞。綜上,并結(jié)合以上圖形可知,當(dāng)卵磷脂:膽固醇小于5:1,包封率一直上升,于5:1達(dá)到最大,隨后開始呈下降趨勢(shì)。當(dāng)卵磷脂:膽固醇=5:1時(shí)粒徑為最小值,大于此值時(shí)粒徑增大。故選取制備脂質(zhì)體適宜的卵膽比為5:1。

    2.3 表面活性劑與總脂材的比對(duì)包封率、粒徑的影響

    在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下,固定其他組分的比例不變,只改變表面活性和總脂材的比例,制備VC脂質(zhì)體,研究表面活性劑[17]對(duì)包封率的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 表面活性劑與總脂材的比對(duì)包封率、粒徑的影響Fig.4 Effect of total lipid/surfactant ratio on encapsulation efficiency and particle size

    聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯,吐溫-80是一種非離子型親水性表面活性劑,含親水性和疏水性的長(zhǎng)鏈。脂質(zhì)體中加入吐溫-80后,吐溫-80物理吸附于脂質(zhì)雙層表面,其聚氧乙烯基從脂質(zhì)雙層中伸出,致密覆蓋在雙層表面,形成有一定厚度的親水相。它屬于“立體屏障”型脂質(zhì)體,比傳統(tǒng)脂質(zhì)體更穩(wěn)定。但是過多的加入其會(huì)造成脂質(zhì)體的泄露,當(dāng)表面活性劑:總脂材小于3:10時(shí),包封率隨之增大而上升,超過其則下降,粒徑在其值小于3:10時(shí)一直下降,大于其則上升,所以取表面活性劑:總脂材=3:10為佳。

    2.4 無水乙醇用量的確定

    在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下,固定其他組分的比例不變,只改變卵磷脂和無水乙醇的比例,制備VC脂質(zhì)體,研究乙醇用量對(duì)成膜、包封率及粒徑的影響,結(jié)果見圖5。

    圖5 磷脂與無水乙醇用量比(g/100mL)對(duì)包封率及粒徑的影響Fig.5 Effect of phospholipids/alcohol ratio on encapsulation efficiency and particle size

    無水乙醇作為成膜時(shí)的有機(jī)溶劑,對(duì)成膜均勻度,成膜好壞有最直接的影響,少量無水乙醇不能溶解磷脂,過多的無水乙醇則不易除去,均會(huì)影響到脂質(zhì)體的均勻性,且由于其為有機(jī)溶劑,用量過多會(huì)造成試劑殘留。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,在比例為2.5g/100mL時(shí),包封率為最大值,粒徑為最小值,經(jīng)試驗(yàn)確定最后用量為2.5g/100mL為最佳。

    2.5 VC與總脂材的比對(duì)包封率及粒徑的影響

    在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1條件下,固定其他組分的比例不變,只改變VC和總脂材的比例,制備VC脂質(zhì)體,研究VC與總脂材的比[18](質(zhì)量比)對(duì)包封率和粒徑的影響,結(jié)果見圖6。

    圖6 總脂材與VC比對(duì)包封率及粒徑的影響Fig.6 Effect of total lipid/vitamin C ratio on encapsulation efficiency and particle size

    VC與總脂材的比對(duì)脂質(zhì)體的外觀和包封率影響也較大,隨著大豆卵磷脂比的增加,包封率增大,粒徑也同時(shí)增大,但是VC與總脂材的比過大則VC容易析出,不能制成較好的VC脂質(zhì)體,包封率不高;比例過小制得的脂質(zhì)體外觀不均勻,粒徑較大,且由于磷脂、膽固醇量較大造成絕對(duì)包封量少。綜合這兩方面因素,取總脂材:VC=20:1為制備比例。

    2.6 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)

    通過正交設(shè)計(jì)確定VC脂質(zhì)體配方。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定了影響VC脂質(zhì)體包封率主要因素:體系中VC的含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量。因此,用L9(34)表正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)(表1),確定VC脂質(zhì)體的最佳配方。

    表1 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

    按上述方法測(cè)定正交設(shè)計(jì)法中每個(gè)組處方制備出的脂質(zhì)體中VC的含量。結(jié)果見表2。

    表2 VC脂質(zhì)體正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

    表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for encapsulation efficiency with various preparation conditions

    從表2和表3可以看出,影響因素主次順序?yàn)镈>C>B>A。最佳組合為A2B2C3D1,即溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10,此組合下得到的包封率可達(dá)42.1%。

    2.7 脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性[19-20]

    對(duì)按最優(yōu)試驗(yàn)組制備的脂質(zhì)體懸液置于4℃下貯藏,并于不同時(shí)間(0、3、6、9、12、15d)取樣進(jìn)行粒徑測(cè)定,結(jié)果見表4。最優(yōu)試驗(yàn)組:磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10、制備溫度65℃,與正交分析最佳組合組相一致。

    表4 貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Storage stability of vitamin C liposomes

    由表4可知,脂質(zhì)體儲(chǔ)藏時(shí)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)造成絮凝結(jié)塊,而在冷藏條件下可延緩此變化,從粒徑出發(fā)考察了該脂質(zhì)體在冷藏條件下的粒徑變化以得到其冷藏穩(wěn)定性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒徑在15d內(nèi)變化不大,可說明脂質(zhì)體的冷藏穩(wěn)定性較好。

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)以卵磷脂、膽固醇為膜材,VC為芯材,采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)對(duì)薄膜水化-超聲法進(jìn)行了制備工藝的優(yōu)化,得到的最佳工藝條件:制備溫度為65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑=10:2,在此條件下脂質(zhì)體包封率可達(dá)42.1%,平均粒度為373.9nm;且脂質(zhì)體在4℃下貯藏,15d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

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    Preparation and Stability of Vitamin C Liposomes

    YANG Shui-bing,LIU Cheng-mei*,LIU Wei,LIU Wei-lin,TONG Gui-hong,ZHANG Yu,ZHENG Hui-juan
    (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

    Lecithin and cholesterol were used the membrane-forming materials to prepare vitamin C liposomes by thin film hydration-ultrasonic method. Based on single-factor experiments, the optimal preparation conditions for vitamin C liposomes were determined by orthogonal array design to be preparation temperature, 65 ℃; lecithin/cholesterolthe mass ratio, 5:1; total lipid/vitamin C mass ratio, 25:1; and total lipid/ surfactant mass ratio 10: 2. An encapsulation efficiency of vitamin C liposomes as high as 42.1% was achieved under these optimal preparation conditions, and the average particle size of the prepared vitamin C liposomes was 373.9 nm. The stability of vitamin C liposomes was investigated by evaluating the change of its average particle size during storage at 4 ℃ for 15 days. The average particle size of vitamin C liposomes had no significant change, suggesting excellent stability.

    vitamin C;liposome;thin film hydration-ultrasonic method;encapsulation efficiency;stability

    R944.1

    A

    1002-6630(2010)20-0230-05

    2010-07-08

    國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z330);國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200808)作者簡(jiǎn)介:楊水兵(1984—),男,博士研究生,研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。

    E-mail:shuibingyang1984@126.com

    *通信作者:劉成梅(1963—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。E-mail:chengmeiliu@yahoo.com.cn

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