基因工程在黃瓜育種中的應(yīng)用

盛 強(qiáng) 史湘華

（遼寧省農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)校 110161）

黃瓜是我國(guó)主要的蔬菜作物。近年來(lái)，隨著我國(guó)黃瓜栽培面積的逐漸擴(kuò)大，黃瓜連作障礙和種性退化現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，新品種的選育就成為黃瓜可持續(xù)生產(chǎn)的關(guān)鍵。黃瓜品種的選育工作始于上世紀(jì)50年代末；60年代黃瓜育種工作的重點(diǎn)是選育抗病育種，人們利用傳統(tǒng)的常規(guī)選育方法育成了津研系列黃瓜；70年代在常規(guī)品種選育的基礎(chǔ)上進(jìn)行了黃瓜雜種一代優(yōu)勢(shì)利用的研究；到了80年代黃瓜育種不僅在抗病性，而且在早熟性、豐產(chǎn)性和品質(zhì)等方面也有較大提高。

傳統(tǒng)的育種方法是通過(guò)雜交、自交和回交等手段培育新品種。育出一個(gè)新品種通常需要5～8年，周期長(zhǎng)、成效低，并且受種質(zhì)資源的限制，可供利用的性狀資源差異越來(lái)越小，所以?xún)H靠現(xiàn)有的種質(zhì)資源和常規(guī)育種方法很難使新品種在抗病性、品質(zhì)方面有較大突破。隨著細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)等一系列現(xiàn)代生物技術(shù)的建立，生物技術(shù)已成為當(dāng)今世界發(fā)展最快、最活躍的高新技術(shù)。20世紀(jì)90年代，基因工程技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于選育黃瓜新品種，現(xiàn)已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。基因工程技術(shù)是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行直接操作，可在優(yōu)良的遺傳背景下只改變個(gè)別性狀而不影響其它性狀，實(shí)現(xiàn)定向改良植物遺傳性狀，提高育種的目的性和可操作性。利用基因工程技術(shù)選育黃瓜品種，在一定程度上解決了黃瓜種質(zhì)資源有限、性狀資源差異不明顯、培育新品種年限長(zhǎng)的難題。在黃瓜育種上，應(yīng)用較多的基因工程技術(shù)有分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的一種新的遺傳標(biāo)記形式。同前幾種標(biāo)記相比，分子標(biāo)記直接以DNA的形式表現(xiàn)，數(shù)量多且多態(tài)性高。許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為顯性、共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息供育種實(shí)踐利用。1980年，Bostein和White等首次提出用RFLP作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜之后，相繼出現(xiàn)了20多種DNA分子標(biāo)記方法，它們的應(yīng)用已覆蓋了生命科學(xué)的許多領(lǐng)域。按其技術(shù)原理，分子標(biāo)記可分為3大類(lèi)：第1類(lèi)是以分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，主要是RFLP；第2 類(lèi)是以 PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)為基礎(chǔ)的一系列分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD（Random Amplified PolymorphicdNA）、SSR（Simple Sequence Repeat）、SCAR （Sequence Characterized Amplified Regions）、STS（Sequence Tagged Site）等；第 3 類(lèi)是以酶切和PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，如AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）。 目前應(yīng)用較多的是RFLP，RAPD，AFLP及 SSR。RFLP是指不同生物的DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化后，通過(guò)分子雜交檢測(cè)酶切同源片段大小上的差異。這種差異是DNA分子堿基突變引起的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的缺失或增加，以及DNA分子片段插入、重復(fù)、缺失等行為造成的。RFLP標(biāo)記一般為共顯性，但RFLP操作較復(fù)雜、費(fèi)用較高。RAPD是一種運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增基因組，尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標(biāo)記的新技術(shù)。RAPD技術(shù)建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上，利用一系列不同的寡聚核苷酸為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD技術(shù)程序簡(jiǎn)單、快捷、成本低。AFLP標(biāo)記的要點(diǎn)是選擇性地?cái)U(kuò)增基因組DNA的限制性酶切片斷。首先用兩個(gè)（也可一個(gè)或多個(gè)）限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，再用與這兩個(gè)酶酶切末端配對(duì)的兩個(gè)雙鏈人工接頭連接限制性酶切的片段作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，其實(shí)質(zhì)是RFLP與PCR結(jié)合的一種技術(shù)。AFLP多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好。該技術(shù)的缺點(diǎn)是通常需用同位素，危害人體健康，成本較高。SSR也叫微衛(wèi)星DNA，是指DNA分子中2～4個(gè)堿基組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，其分布遍及人類(lèi)和動(dòng)植物的所有染色體及染色體各個(gè)片段。不同品種間其重復(fù)單位數(shù)有極高的變異。根據(jù)其兩端特異序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組中的重復(fù)序列位點(diǎn)，分析基因組的多態(tài)性。該標(biāo)記具有RAPD標(biāo)記的所有優(yōu)點(diǎn)，且多態(tài)性更豐富，同時(shí)又克服了RAPD缺點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性。但要獲得SSR引物需要進(jìn)行大量克隆、測(cè)序和雜交驗(yàn)證工作。

分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜上的應(yīng)用沒(méi)有十字花科、茄科作物普遍，但在黃瓜遺傳及育種的研究中起著重要作用。遺傳圖譜是植物遺傳育種及分子克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記數(shù)目少，難以形成一個(gè)較為完整的連鎖圖。RFLP自發(fā)明后就被廣泛用于植物的遺傳作圖，而RAPD標(biāo)記多態(tài)性豐富，操作簡(jiǎn)單，用于構(gòu)建遺傳圖譜比RFLP更為快速、經(jīng)濟(jì)。對(duì)那些已建立了RFLP圖譜的植物，可以利用RAPD技術(shù)找到新的標(biāo)記補(bǔ)充到RFLP圖譜中。AFLP雖然建立的時(shí)間較短，但因多態(tài)性信息非常豐富，同時(shí)重演性和可信度又比RAPD高得多，是構(gòu)建飽和圖譜的有力工具。目前，通過(guò)RFLP、RAPD、SCAR和STS標(biāo)記技術(shù)已構(gòu)建了黃瓜等20種蔬菜遺傳圖譜，其中番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)等蔬菜作物的圖譜已趨于飽和。

Staub等利用分子標(biāo)記技術(shù)將來(lái)源于國(guó)家植物種質(zhì)系統(tǒng) （NPGS）的922份黃瓜種質(zhì)材料與118份栽培黃瓜材料進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)栽培材料的遺傳背景十分狹窄，而前者的遺傳多樣性較豐富。借助分子標(biāo)記技術(shù)，可以將來(lái)源于NPGS黃瓜中的基因通過(guò)回交引入栽培黃瓜，進(jìn)行品種改良。

利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行蔬菜品種鑒定不受環(huán)境、取材部位、時(shí)間等因素影響，而且信息量大，可以準(zhǔn)確、快速區(qū)分出形態(tài)標(biāo)記難以鑒別的細(xì)微差異。品種鑒定首先需要構(gòu)建品種的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜，將需要鑒定的品種的指紋與標(biāo)準(zhǔn)指紋進(jìn)行比較分析，即可知道品種的純度和真?zhèn)巍?/p>

由于受環(huán)境因素影響很大，傳統(tǒng)的基因定位方法進(jìn)行基因標(biāo)記所得的遺傳圖譜可靠性較低。而利用分子標(biāo)記技術(shù)可以提高遺傳分析的準(zhǔn)確性和選種、育種的有效性。國(guó)艷梅通過(guò)AFLP技術(shù)對(duì)控制黃瓜苦味的基因bi進(jìn)行了引物篩選，得到了兩個(gè)有效引物。Hallden找到了與抗病基因緊密連鎖的PCR標(biāo)記。張海英用RAPD技術(shù)找到了歐洲溫室類(lèi)型黃瓜材料的特征譜帶。

目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源、基因定位、抗病育種和品種的純度鑒定等方面研究取得了一定的進(jìn)展。如何利用分子標(biāo)記技術(shù)挖掘和利用黃瓜的種質(zhì)資源中的優(yōu)良基因是將來(lái)分子生物學(xué)在黃瓜品種改良上應(yīng)用研究的重點(diǎn)。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

基因工程是在重組DNA技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，它是以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，綜合了分子生物學(xué)、微生物學(xué)和植物組織培養(yǎng)等現(xiàn)代技術(shù)和方法。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指一種或幾種生物體的基因或載體先在體外按照人們的設(shè)計(jì)拼接，然后轉(zhuǎn)入另外一種生物體內(nèi)，使之依照人們的意愿遺傳，表達(dá)出人們所希望的新性狀。即將外源目的基因經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)修改，通過(guò)生物、物理或化學(xué)的方法導(dǎo)入另外一種生物體內(nèi)，以改良其性狀，得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲(chóng)及抗逆性強(qiáng)的新品種。

目前轉(zhuǎn)入外源基因的方法主要包括根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)移法和外源基因直接導(dǎo)入法，后者又包括EFG法、電激法、生物射彈法（基因槍法）、花粉管道法、微注射法等等。EFG法、電激法、脂質(zhì)體法均以原生質(zhì)為受體，操作需格外精細(xì)；基因槍法雖然導(dǎo)入效率高，適用對(duì)象廣，但因設(shè)備較貴，應(yīng)用受到限制；花粉管通道法不需要精密儀器，操作相對(duì)簡(jiǎn)易，可在大田條件下運(yùn)用，較適合我國(guó)國(guó)情，發(fā)展前景較好。

到目前為止，已進(jìn)行轉(zhuǎn)基因并獲得轉(zhuǎn)基因植株的蔬菜有番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、菠菜、生菜、甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、黃瓜、西葫蘆、豇豆、茄子、辣椒、石刁柏等，所改良的農(nóng)藝性狀包括抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、延熟保鮮及其它品質(zhì)。黃瓜體細(xì)胞再生與轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將外源的抗病、抗蟲(chóng)、抗逆及特有品質(zhì)等有效基因?qū)胫参矬w，從而產(chǎn)生具有新性狀的植株，培育出新的抗病、抗蟲(chóng)、抗逆等優(yōu)良品種。轉(zhuǎn)基因黃瓜不僅可以保留原來(lái)優(yōu)良的豐產(chǎn)性、商品性，而且獲得了新的抗病性或抗除草劑等特性，可以大幅度節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃瓜轉(zhuǎn)水稻幾丁質(zhì)酶基因植株可以提高對(duì)灰霉病的抗性，還可以產(chǎn)生對(duì)CMV的抗性。病毒病是黃瓜最主要的病害之一，近年來(lái)已實(shí)現(xiàn)了把抗病毒病基因轉(zhuǎn)入到黃瓜體內(nèi)。鰈魚(yú)科的抗凍基因轉(zhuǎn)入黃瓜中，可提高黃瓜抗冷性，為發(fā)展冷凍保鮮蔬菜提供了條件。天津科潤(rùn)黃瓜研究所正在利用建立的黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)，開(kāi)展黃瓜耐鹽基因、抗除草劑基因的轉(zhuǎn)化研究，并已經(jīng)取得階段性成果。

轉(zhuǎn)基因工程在黃瓜遺傳育種、品質(zhì)改良上的應(yīng)用前景是十分樂(lè)觀，最近十幾年來(lái)已取得很大進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因蔬菜成果已經(jīng)在生產(chǎn)上得到應(yīng)用。另外，基因工程帶來(lái)明顯經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也有可能產(chǎn)生一些潛在的負(fù)面影響，比如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全性以及是否可能帶來(lái)生態(tài)破壞等。雖然我們已經(jīng)建立了相關(guān)法規(guī)和條例，并對(duì)產(chǎn)品安全性進(jìn)行了評(píng)估和監(jiān)控，但仍要加強(qiáng)管理和監(jiān)督，加大宣傳力度，使轉(zhuǎn)基因蔬菜有更加廣闊的發(fā)展前景。

目前，生物技術(shù)在黃瓜新品種選育上還沒(méi)有得到普遍應(yīng)用，有些技術(shù)還處于研究階段，如利用分子標(biāo)記進(jìn)行系譜分析和定位，品系、品種和雜種的鑒定及品質(zhì)、抗病性鑒定等還只是作為黃瓜育種的輔助手段。雖然轉(zhuǎn)基因工程在抗性、品質(zhì)改良方面有一定的應(yīng)用，但仍然存在著許多不容忽視的問(wèn)題，如轉(zhuǎn)化率低，結(jié)果不穩(wěn)定等。因此，我們?cè)诩訌?qiáng)轉(zhuǎn)基因育種研究的同時(shí)要解決好基因工程與常規(guī)育種的關(guān)系，使其盡快轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。我們相信，生物技術(shù)必將對(duì)黃瓜育種方法產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，為蔬菜產(chǎn)業(yè)及整個(gè)農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出越來(lái)越大的貢獻(xiàn)。