海洋浮游病毒的研究方法

李洪波, 肖 天, 林鳳翱

(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心, 遼寧 大連 116023; 2. 國(guó)家海洋局海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 3.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

海洋浮游病毒的研究方法

Methods of studying marine virioplankton

李洪波1,2, 肖 天3, 林鳳翱1

(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心, 遼寧 大連 116023; 2. 國(guó)家海洋局海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 3.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

浮游病毒在海洋中大量存在, 利用超離心和透射電鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)病毒豐度為 105～107個(gè)/mL, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)菌的數(shù)量。由于浮游病毒在微食物環(huán)、生源要素的循環(huán)及對(duì)宿主細(xì)胞的裂解以及控制宿主多樣性方面都具有重要作用[1～3], 所以世界各國(guó)對(duì)海洋病毒的研究發(fā)展迅速。由于技術(shù)方法方面的原因, 國(guó)內(nèi)在這方面剛剛起步不久。盡管在淡水病毒研究方面已取得了一些進(jìn)展[4], 但在海洋研究領(lǐng)域, 此部分工作還很薄弱。國(guó)內(nèi)在海洋魚(yú)類(lèi)病毒、貝類(lèi)病毒等流行性病毒方面已取得較大進(jìn)展[5～7], 而本文則將對(duì)海洋浮游病毒研究中所涉及的豐度、生產(chǎn)力以及病毒對(duì)宿主的影響方面的技術(shù)進(jìn)行重點(diǎn)闡述。

1 病毒豐度的測(cè)定

1.1 間接計(jì)數(shù)法: 空斑法(plaque assay)與 MPN(most-probable-number)法

適量的噬菌體和宿主菌液混合后接種培養(yǎng), 培養(yǎng)基表面可有透亮的溶菌空斑出現(xiàn)。一個(gè)空斑系由一個(gè)噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成, 稱(chēng)為噬斑(plaque)。不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同。若將噬菌體按一定倍數(shù)稀釋, 通過(guò)噬斑計(jì)數(shù), 可測(cè)定一定體積內(nèi)的噬斑形成單位(plaque forming units,pfu)數(shù)目, 即噬菌體的數(shù)目。另外利用液體培養(yǎng)基作最大可能數(shù)目(MPN)分析。用該方法計(jì)數(shù)明顯低于用顯微鏡鏡檢100～1000倍[8]。

盡管這個(gè)方法在計(jì)數(shù)病毒中并不是很有效, 但在分離純化病毒-宿主系統(tǒng)中有不可替代性。尤其是在噬藍(lán)藻體的研究中, 如在墨西哥灣, Suttle[9]利用MPN法方法發(fā)現(xiàn)水中的噬藍(lán)藻體超過(guò)105個(gè)/mL。

1.2 直接計(jì)數(shù)法

1.2.1 透射電鏡技術(shù)(Transmission electron microscopy, TEM)

早期直接計(jì)數(shù)水體病毒(viral direct counts, VDC)的方法是用電鏡技術(shù)。1979年, Torella and Morita[10]利用電鏡第一次直接計(jì)數(shù)了＞0.2 μm 的浮游生物樣品中的病毒豐度為＞104個(gè)/mL。因大多數(shù)病毒通過(guò)了0.2 μm的濾膜, 其豐度被大大低估了。電鏡計(jì)數(shù)樣品中的病毒顆粒大約在 103～106個(gè)/mL。電鏡技術(shù)可同時(shí)提供病毒形態(tài)多樣性方面的證據(jù), 包括蛋白外殼和尾部大小[11]。

最普通的電鏡方法是直接沉降自由的病毒顆粒,從未過(guò)濾的由戊二醛固定的水樣沉降到 Formvar-噴碳銅網(wǎng)上。有兩種方法可把水體中的病毒收集到銅網(wǎng)上： 超濾(ultrafiltration)和超離(ultracentrifugation)。通過(guò)超離病毒直接收集在電鏡銅網(wǎng)上或者通過(guò)濃縮后轉(zhuǎn)移到銅網(wǎng)上, 然后在電鏡下觀察[11～13]。TEM 病毒直接計(jì)數(shù)要求顆粒達(dá)到的最低濃度是 105個(gè)/mL, 因而在貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中TEM技術(shù)受到限制[14]。另外由于染色和在銅網(wǎng)上的不均勻分布, 導(dǎo)致計(jì)數(shù)自然水域的病毒有大約20%～25%的誤差[15]。

TEM 直接計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)是裝備要求高, 如透射電子顯微鏡和超速離心機(jī)。另外樣品準(zhǔn)備和分析也是耗時(shí)繁瑣的。

1.2.2 熒光顯微鏡技術(shù)(epifluorescence light microscopy, ELM)

本質(zhì)上說(shuō), 熒光顯微鏡計(jì)數(shù)病毒是在直接計(jì)數(shù)細(xì)菌技術(shù)上的變更。病毒殼內(nèi)的核酸被核酸染料染色, 病毒被過(guò)濾到小孔徑(≤002 μm)濾膜上, 用高倍鏡觀察。一個(gè)明顯的缺點(diǎn)就是小的浮游細(xì)菌和大的病毒顆粒在大小上重疊, 這會(huì)導(dǎo)致病毒計(jì)數(shù)的偏差。通過(guò)提高染料的特異性, ELM 直接計(jì)數(shù)病毒方法已與 TEM方法達(dá)到相似的準(zhǔn)確度, 且超過(guò)TEM計(jì)數(shù)結(jié)果[15]。

在新的熒光標(biāo)記物SYBR Green I出現(xiàn)之前, 有用DAPI和Yo-Pro-1染色劑的[15,16], 現(xiàn)在也有新的替代品, 有研究認(rèn)為利用SYBR Green Gold 染色效果會(huì)更好, 但染料昂貴, 不值得推薦。另外研究[17]認(rèn)為YO-PRO-1染料更適合熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)病毒, 是因?yàn)榇巳玖嫌休^強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光。相比SYBR Green I染料熒光淬滅較快, 不易計(jì)數(shù)和拍照。YO-PRO-1可被波長(zhǎng)為 491nm的藍(lán)光激發(fā), 發(fā)出波長(zhǎng)為509 nm的黃綠色熒光。但由于其染色時(shí)間較長(zhǎng), 長(zhǎng)達(dá)2 d, 使用起來(lái)不方便。而SYBR Green I染色時(shí)間較短(小于15 min), 亮度較高, 且不受固定劑的影響。只要在染色后添加熒光保護(hù)劑, 就可避免熒光淬滅過(guò)快[17～19]。

中國(guó)詩(shī)歌中傳達(dá)“意境”的思想源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，（陶淵明《飲酒》）“采菊東籬下，悠然見(jiàn)南山”中東籬是實(shí)實(shí)在在的事物，“東籬”后來(lái)常被詩(shī)人作詩(shī)用到。（李清照《醉花陰》）“東籬把酒黃昏后，有暗香盈袖”這句詩(shī)中的“東籬”便不是實(shí)指在東籬喝酒作樂(lè)，而是指一種意境。詩(shī)中的意象也是不勝枚舉，例如關(guān)乎離別的意象是“楊柳”（楊柳東風(fēng)樹(shù)，青青夾御河）；關(guān)乎思念家鄉(xiāng)的意象是“明月”（舉頭望明月，低頭思故鄉(xiāng)）；關(guān)乎思友的意象是“白云”（水底分明天上云，可憐形影似吾身）。譯者要深入詩(shī)中意境觀其意象，感受詩(shī)人此時(shí)此景的特殊情感，才能收受其意象的感染力。

由于固定劑和保存條件的不同, 常常低估了病毒的豐度。研究認(rèn)為用戊二醛和甲醛固定的樣品, 在其前 2小時(shí)內(nèi), 病毒平均損失率分別為 0.12 h-1和0.13 h-1。16天后, 病毒豐度已下降了72%。要準(zhǔn)確測(cè)定病毒豐度, 最好采樣后不用固定劑而是立即抽濾染色, 把制成的玻片放置在-20℃, SYBR Green I染色的可放置 2周, 而用 Yo-Pro-1染色的可放置 1年。另一方面, 樣品固定后用液氮瞬時(shí)冷凍后在-80℃條件下保存。只有做到以上兩點(diǎn)才可避免對(duì)病毒豐度的低估[20]。一種新型熒光探針 GeneFinderTM,價(jià)格相對(duì)便宜, 效果與SYBR Green I效果不差上下。熒光顯微鏡適合現(xiàn)場(chǎng)研究病毒豐度。

1.2.3 流式細(xì)胞儀技術(shù)(Flow Cytometry, FCM)

近十幾年來(lái), 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry) 已被廣泛應(yīng)用于海洋生物學(xué)研究。最初被用于植物種群的區(qū)分與計(jì)數(shù), 接著又被用于異養(yǎng)細(xì)菌群落研究,而這幾年則被開(kāi)發(fā)用于海洋病毒的分析[21]。流式細(xì)胞術(shù)主要優(yōu)勢(shì)在于能快速分析大量細(xì)胞, 并獲取數(shù)據(jù)易于進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析, 準(zhǔn)確性得到提高, 誤差減小, 檢測(cè)下限與靈敏度都得以提高。同時(shí)新型核酸染料 SYBR Green-I 的發(fā)明也推進(jìn)了流式在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[19,21]。Chen 等[22]用 FCM法分辨出至少4種不同病毒類(lèi)型, 可分為真核藻類(lèi)病毒、原核藻類(lèi)病毒、高DNA噬菌體和低DNA噬菌體。

2 病毒生產(chǎn)力的研究方法

2.1 放射性標(biāo)記技術(shù)

來(lái)源于測(cè)定細(xì)菌二次生產(chǎn)力的方法[23], Steward開(kāi)創(chuàng)了[3H]或[32P]被病毒核酸吸收基礎(chǔ)上的現(xiàn)場(chǎng)估計(jì)病毒生產(chǎn)力的方法[24]。這個(gè)方法的基本原理是用3H或32P標(biāo)記浮游病毒的核酸, 然后計(jì)數(shù)宿主裂解后的放射性標(biāo)記物的量, 這個(gè)量所代表的就是病毒生產(chǎn)量, 最后用病毒生產(chǎn)量除以病毒的平均裂解量(burst size)就能夠推算出被感染的宿主數(shù)量。這個(gè)方法有一個(gè)假設(shè)前提, 那就是： 噬菌體合成中用的核苷酸來(lái)源于宿主細(xì)胞核酸庫(kù)或者外源的而并非重新合成的[25]。這個(gè)方法依賴(lài)于過(guò)濾把細(xì)菌和病毒分離開(kāi)來(lái), 然后測(cè)量標(biāo)記的病毒DNA數(shù)量。在將放射性標(biāo)記量轉(zhuǎn)化成病毒的生產(chǎn)量時(shí), 還需要一個(gè)轉(zhuǎn)化系數(shù)。通常這個(gè)系數(shù)是通過(guò)比較用其他方法測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)PHS (phage-host system)中的病毒的數(shù)量變化和放射性標(biāo)記物的數(shù)量變化來(lái)得到的[24,25]。但迄今為止,系數(shù)的選擇沒(méi)能達(dá)成統(tǒng)一, 不同的研究者使用這種方法得到的病毒導(dǎo)致的致死率是有極大差異的。在用3H-TdR作為示蹤物時(shí), 使用的轉(zhuǎn)換系數(shù)有6.17×1020個(gè)/mol或 2×1021個(gè)/mol。在用32Pi作為示蹤物時(shí)候, 轉(zhuǎn)化系數(shù)為 1.25×1020個(gè)/mol。由于32Pi在DNA病毒測(cè)量中的限制, 目前3H-TdR比32Pi被更廣泛的應(yīng)用[26,27]。

此方法能夠直接測(cè)定病毒的生產(chǎn)速率并推算它所造成的致死率, 而且也可以用于直接記錄病毒粒子的降解率, 同時(shí)還提供了有關(guān)物質(zhì)從浮游細(xì)菌流向浮游病毒的直接證據(jù)[24]。缺點(diǎn)是被標(biāo)記的細(xì)菌DNA容易分解成病毒大小的部分, 同時(shí)需要適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化系數(shù)把放射性標(biāo)記量轉(zhuǎn)化為病毒生產(chǎn)量。

2.2 熒光標(biāo)記病毒(Fluorescently Labeled Viruses, FLV)技術(shù)[28]

此方法與放射性標(biāo)記的原理一樣, 更使用于貧營(yíng)養(yǎng)和避光培養(yǎng)的PHS 體系。該方法能同時(shí)測(cè)定病毒降解率、生產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。熒光標(biāo)記的病毒作為示蹤物添加到培養(yǎng)水體中, 監(jiān)測(cè)FLVs和總病毒豐度的變化。病毒生產(chǎn)率能用FLV豐度的改變率和總豐度的變化率計(jì)算得出。缺點(diǎn)是需要制備熒光標(biāo)記的病毒顆粒, 這個(gè)過(guò)程比較繁瑣, 利用率較低。

2.3 氰化物抑制法

假定病毒豐度保持相對(duì)穩(wěn)定(病毒衰減被病毒生產(chǎn)所平衡), 那么病毒生產(chǎn)停止后就可以從病毒移除率中估算出來(lái)病毒生產(chǎn)率[29,30]。病毒衰減率是利用抑制新病毒顆粒的產(chǎn)生, 然后檢測(cè)一段時(shí)間內(nèi)病毒豐度的降低而被估算出來(lái)的。氰化物經(jīng)常被用作抑制劑殺死宿主細(xì)胞而并不能使自由的噬菌體顆粒失去活性。由于太陽(yáng)光輻射、酶還有其他因素均可引起病毒的衰減。因而在不同地區(qū)利用病毒衰減得到的生產(chǎn)率沒(méi)有可比性[31], 限制了該方法的推廣。

2.4 稀釋方法

2002年, Wilhelm等[32]用稀釋技術(shù)估計(jì)了病毒生產(chǎn)力。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單, 已在較多科研方面得到應(yīng)用。具體操作如下： 把450 mL水樣中的細(xì)菌收集到直徑47 mm、孔徑0.2 μm的聚碳酸酯膜。然后用不含病毒顆粒的超濾海水(＜30 ku)把濾膜上的細(xì)胞重新懸浮起來(lái), 保持到最初體積。這樣病毒豐度就被稀釋到大約原濃度的10%～20%。水樣分裝到3個(gè)瓶子, 用鋁箔包裹, 現(xiàn)場(chǎng)溫度下培養(yǎng)。每隔2.5 h取樣一次(4 mL, 戊二醛固定, 終濃度2.5%)。每一個(gè)試驗(yàn)限制在10 h內(nèi)。

用病毒生產(chǎn)量對(duì)時(shí)間的一階線形回歸得到病毒平均生產(chǎn)率(個(gè)/(mL·h))。

到目前為止, 測(cè)定病毒生產(chǎn)力并沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的方法。上面的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。然而, 獲取可靠的生產(chǎn)力對(duì)于估計(jì)病毒對(duì)細(xì)菌死亡率的貢獻(xiàn)和病毒介導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)鹽釋放都是非常重要的。

3 病毒介導(dǎo)的死亡率(Virus induced mortality, VIM)

3.1 以電鏡方法為基礎(chǔ)研究病毒介導(dǎo)的死亡率

透射電鏡(TEM)被用來(lái)觀看病毒形態(tài)和決定被感染的細(xì)胞頻率(Frequency of visibly infected cells,FVIC), 包含病毒的細(xì)胞數(shù)目。包含成熟噬菌體的浮游細(xì)菌僅代表被病毒感染數(shù)量的一小部分, 因?yàn)橥暾麩o(wú)缺的病毒外殼只有在感染周期的后期才能看到。為了準(zhǔn)確估計(jì)病毒溶源效應(yīng), 需要利用轉(zhuǎn)換因子把FVIC值轉(zhuǎn)化為全部被感染的細(xì)胞頻率(FIC)[33～35]。用到的轉(zhuǎn)化因子有 10, 4.34～10.78(平均 7.11)[34], 3.7～7.14[36]。Binder[33]認(rèn)為在FVIC與FIC之間存在非線性的關(guān)系, 得到如下的數(shù)學(xué)模型：

MVMB(viral-mediated bacterial mortality, MVMB)代表采樣時(shí)間給定的細(xì)菌種群內(nèi)病毒介導(dǎo)的死亡率,能利用下面的模型推導(dǎo)出來(lái)[33]：

而病毒介導(dǎo)的細(xì)菌死亡率可由下式計(jì)算得出,MVIM= MVMB×PB(細(xì)菌生產(chǎn)力)[35]。

在河北沿岸采取該方法, 研究了春季由病毒感染而導(dǎo)致的細(xì)菌死亡率達(dá) 40%PB以上[37], 由此證明在近岸富營(yíng)養(yǎng)化海區(qū)病毒對(duì)細(xì)菌衰亡、碳循環(huán)過(guò)程都有重要的作用。

3.2 以稀釋方法來(lái)估計(jì)由病毒引起的細(xì)菌死亡率

由于VIM代表用裂解量去除病毒生產(chǎn)力得到的由于病毒溶源而裂解的細(xì)胞數(shù)目[30], 即VIM = 病毒生產(chǎn)力/裂解量。要得到由于病毒感染而死亡的細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的比例, 那么得到的 VIM還需除以細(xì)菌豐度, 即VIM(%) = (病毒生產(chǎn)力/裂解量) /細(xì)菌豐度。裂解量(Burst Size)被估計(jì)為所有可見(jiàn)感染的細(xì)胞內(nèi)的平均病毒顆粒(最小裂解量)或者細(xì)胞內(nèi)完全裝滿(mǎn)病毒顆粒的平均病毒數(shù)量(最大裂解量)。病毒裂解量通過(guò)計(jì)數(shù)至少有 15個(gè)可見(jiàn)的感染細(xì)菌細(xì)胞(visibly infected bacterial cell, VIC)內(nèi)的病毒顆粒, 每一個(gè)可見(jiàn)感染細(xì)胞內(nèi)至少要有 5個(gè)噬菌體。在文獻(xiàn)內(nèi)常用的裂解量有兩個(gè)值 20和 50, 平均值為 24[8]。BS受到許多因素的影響, 如宿主細(xì)胞和病毒的大小、宿主和噬菌體的代謝活性以及宿主多樣性、溫度、季節(jié)等[30]。

Suttle[1]綜述認(rèn)為由于病毒感染, 每天大約有10%～20%的異養(yǎng)細(xì)菌消失, 藍(lán)細(xì)菌則相當(dāng)少(大約3%)。在自然環(huán)境里, 由病毒介導(dǎo)的細(xì)菌死亡率大約為 15%～20% d-1[1,30]。

4 病毒對(duì)宿主多樣性的影響

病毒對(duì)海洋系統(tǒng)最令人關(guān)注的就是對(duì)群落組成的潛在影響。這是因?yàn)椋?(1)病毒對(duì)宿主通常是特異性的, 大多情況下被認(rèn)為是種類(lèi)特異性[38]; (2)感染是一個(gè)依賴(lài)密度的過(guò)程。在高密度宿主情況下, 增加的接觸率導(dǎo)致感染率升高。根據(jù)上面兩個(gè)情況, 有專(zhuān)家提出病毒對(duì)宿主的感染符合“殺死優(yōu)勝者” (Killing-the-winner)的假設(shè)[1,39]。

一個(gè)典型病毒控制宿主群落多樣性的試驗(yàn)就是在存在和缺乏病毒情況下, 細(xì)菌群落的改變狀況。試驗(yàn)如下： 接種體用0.6 μm聚碳酸酯核孔濾膜過(guò)濾的自然海水(除去原生動(dòng)物)。培養(yǎng)體是兩種, 一種是用0.02 μm核孔氧化鋁濾膜過(guò)濾不含病毒的海水; 另一種是用0.2 μm核孔濾膜過(guò)濾的包含病毒的海水。培養(yǎng)2～4 d, 利用DGGE技術(shù)監(jiān)控細(xì)菌群落組成的改變狀況[40]。

對(duì)浮游病毒的研究不單單要研究其生態(tài)分布狀況, 今后還要加強(qiáng)如下工作： (1)病毒在元素循環(huán)方面的貢獻(xiàn); (2)由病毒引起的宿主死亡率大小; (3)病毒形態(tài)、基因多樣性研究; (4)利用病毒進(jìn)行赤潮治理方面的研究。

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Q331

A

1000-3096(2010)09-0097-05

2008-10-08;

2008-12-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40906082); 國(guó)家海洋局青年基金資助項(xiàng)目(2010111); 國(guó)家海洋局海洋生態(tài)與海洋生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(LMEB 200604); 中國(guó)科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助項(xiàng)目(KLMEES201002)

李洪波(1976-), 男, 河南漯河人, 助理研究員, 博士, 主要從事海洋微生物生態(tài)研究, 電話： 0411-84782711, E-mail： hbli@nmemc.gov.cn

(本文編輯： 張培新)