一株苯乙烯生物降解菌的分離、鑒定及其特性研究

門 娟，張朝正，李 舫，孔大為

（1.天津市塘沽區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，天津 300450；2.天津市天人和環(huán)保技術(shù)研發(fā)中心，天津 300450；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

苯乙烯為無色透明油狀液體，易燃，有毒，難溶于水，能溶于醇類及醚類，廣泛用于塑料、合成橡膠、樹脂等生產(chǎn)中，是一種有重要價(jià)值的化合物．在苯乙烯的生產(chǎn)、使用、運(yùn)輸、貯藏過程中會(huì)有較大量苯乙烯進(jìn)入大氣和水體，造成大氣和水的污染，同時(shí)對(duì)人體健康有害．全球研究者自20世紀(jì)70年代以來己從各地土壤、廢水中分離到有苯乙烯降解能力的多種微生物[1-2]，取得了一定的成果，其中Pseudomonas fluorescens ST[3]，Actinomycetes[4]，Rhodococcus pyridinovorans[5]，Brevibacillus sp.[6]，Pseudomonas sp.SR-5[7]，Pseudomonas putida SN1[8]等均研究報(bào)道效果明顯．也有研究者采用其它方法進(jìn)行苯乙烯的降解研究[9-10]．

本文采用唯一碳源篩選的方法，從苯乙烯生產(chǎn)廠家處理污水的活性污泥中分離出一株高效苯乙烯降解菌，對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定，研究了該菌株在不同條件下的降解能力，考核了在實(shí)際污水中的降解效果．通過研究其特性，有助于了解其降解機(jī)理，以便改進(jìn)含苯乙烯的工業(yè)廢水的處理，并利用微生物的凈化能力，在一定程度上解決環(huán)境污染問題．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 活性污泥

天津塘沽苯乙烯生產(chǎn)廠家處理污水的活性污泥，由塘沽區(qū)環(huán)保局環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站采樣．

1.1.2 主要試劑

酵母粉，蛋白胨，牛肉膏，NaCl，葡萄糖，瓊脂粉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，硫酸銨，硫酸鎂，所有試劑均為生化試劑或者分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器

自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，Biolog公司；PCR儀，電泳儀，電擊儀，核酸蛋白分析儀均為Bio-rad公司產(chǎn)品；氣相色譜，Agilent6890N．

1.1.4 培養(yǎng)基

唯一碳源培養(yǎng)基（液體）：硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉1.3g/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.0，121℃滅菌20 min．接種前加入配制好的一定量的苯乙烯瓊脂塊．

唯一碳源培養(yǎng)基（固體）：硫酸銨2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，磷酸氫二鈉1.3 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH7.0，121℃滅菌20 min，倒平皿前加入1%體積的苯乙烯．

苯乙烯瓊脂塊：瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，待冷卻到50~60℃時(shí)加入1%體積的苯乙烯，混勻后倒平皿（稍厚）．用刀切成小塊備用，放置時(shí)間不要超過1 h．

按照黨中央、國(guó)務(wù)院和云南省委、省政府關(guān)于生態(tài)文明建設(shè)和決戰(zhàn)脫貧攻堅(jiān)的決策部署，緊密聯(lián)系林業(yè)現(xiàn)代化建設(shè)和改革發(fā)展實(shí)際，圍繞增綠、增質(zhì)、增效和提供更多優(yōu)質(zhì)生態(tài)產(chǎn)品以滿足人民日益增長(zhǎng)的優(yōu)美生態(tài)環(huán)境需要的目標(biāo)，云南省對(duì)林業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和配套措施的探索，長(zhǎng)期走在國(guó)內(nèi)前列。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯乙烯降解菌株的分離

將一定量的活性污泥放入100mL無菌水中，輕微震蕩，然后放于30℃培養(yǎng)箱中活化30min，震蕩使菌體盡可能多的從污泥上洗脫下來．將一定量的從污泥上洗脫下來的菌液接種到唯一碳源培養(yǎng)基（液體）中，30℃培養(yǎng)2 d；培養(yǎng)液涂布在唯一碳源培養(yǎng)基（固體）上，30℃培養(yǎng)，挑取較大的單菌落進(jìn)行鏡檢，同時(shí)接種到唯一碳源培養(yǎng)基（液體）中30℃培養(yǎng)2d，然后再涂布在唯一碳源培養(yǎng)基（固體）上．經(jīng)反復(fù)篩選，最后篩選出一株以苯乙烯為唯一碳源生長(zhǎng)且具有高效降解能力的菌株，保存在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中．

1.2.2 菌體生物量與苯乙烯含量的測(cè)定

菌體生物量用核酸蛋白分析儀測(cè)定，把取得的發(fā)酵液6000r/min離心，菌體用無菌水洗滌3次，用相同體積的無菌水稀釋，然后用核酸蛋白分析儀檢測(cè)菌懸液在600 nm下的吸光度值，表征菌體的生物量，測(cè)定時(shí)以水作為空白．

采用氣相色譜儀Agilent 6890N（帶頂空自動(dòng)進(jìn)樣器）對(duì)苯乙烯的濃度進(jìn)行檢測(cè)．

頂空自動(dòng)進(jìn)樣器的條件：閥溫60℃，平衡時(shí)間20 min，進(jìn)樣量1L，頂空瓶（20 mL）中樣品液體積10 mL．

1.3 菌株的鑒定

菌株的鑒定采取文獻(xiàn) [11]上的方法．

2 結(jié)果與討論

2.1 苯乙烯降解菌株的分離

把活性污泥洗脫液接種到唯一碳源液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)2d，然后把培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上涂布，再把固體平板上的單菌落接種到液體培養(yǎng)基中，通過反復(fù)4次接種涂布，最后分離得到一株以苯乙烯作為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，該菌株對(duì)苯乙烯有很強(qiáng)的降解能力，命名為MJ001．

2.2 菌株的形態(tài)及生化特性

菌株MJ001在固體培養(yǎng)基上，菌株形態(tài)見圖1．個(gè)體形態(tài)為稍彎、兩端鈍圓的桿菌，大小0.5~0.7，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)．革蘭氏染色陰性，著色不明顯，兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度30℃，最適pH6.7~7.4，三糖鐵實(shí)驗(yàn)K/K，氧化酶反應(yīng)陽性．

圖1 菌株MJ001的形態(tài)Fig.1 The configuration of MJ001

2.3 菌株MJ001的16SrDNA序列分析

細(xì)菌的16SrDNA結(jié)構(gòu)具有保守性，能反應(yīng)出生物物種的親緣關(guān)系，為生物系統(tǒng)的進(jìn)化提供線索，也是生物物種的特征核苷酸序列．目前，16S rDNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最有力也是最常用的工具．

以菌株的總DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1436bp的DNA，測(cè)定其基因序列，將測(cè)序結(jié)果輸入Gen Bank，用Blast軟件與已知的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果知道該菌株采用16SrDNA序列分析的方法鑒定為Pseudomonas sp.．菌株的16S rDNA序列見圖2．

圖2 MJ001的16S rDNA序列Fig.2 The16S rDNA sequence of MJ001

2.4 菌株的Biolog鑒定

根據(jù)MJ001的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（革蘭氏染色陰性，三糖鐵實(shí)驗(yàn)K/K，氧化酶反應(yīng)陽性）確定MJ001的培養(yǎng)類型為GN-ENT（革蘭氏陰性腸道菌），把MJ001接種到BUG+B培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)16h后用棉簽把菌落沾起，分散到GN/GP-IF（細(xì)菌專用接種液）中，制備成均一的菌懸液，調(diào)整濁度到52%±3%（透光度），然后接種到 GN（革蘭氏陰性菌）鑒定板上，接種量150L，30℃培養(yǎng)．對(duì)MJ001在鑒定板上培養(yǎng)4~6 h和16~24 h的結(jié)果讀取了數(shù)據(jù)，鑒定結(jié)果顯示與Pseudomonas aeruginosa最接近．

圖3給出了Biolog鑒定16~24 h時(shí)，MJ001對(duì)鑒定板上不同碳源的代謝情況．Biolog GN鑒定板上A1孔是水，其它95孔中為不同種類的碳源，種類包括有機(jī)酸、氨基酸和糖類等．圖3顯示在16~24 h時(shí)，MJ001對(duì)96微孔板中的59種碳源利用明顯，20種利用微弱，而對(duì)其中的16種碳源根本不利用，這和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)上的報(bào)道十分接近．

2.5 不同苯乙烯濃度下菌體生長(zhǎng)情況及菌株MJ001的降解效果

把菌株接種在含有不同濃度苯乙烯的唯一碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)，間隔2h取樣，用核酸蛋白分析儀檢測(cè)菌懸液在600nm下的吸光度值，比較不同苯乙烯濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響．從接種6h開始，間隔4 h取樣，檢測(cè)苯乙烯的降解情況．圖4是不同苯乙烯濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響圖，圖5是不同苯乙烯濃度對(duì)菌株MJ001的苯乙烯降解率的影響．

從圖4可以看出MJ001在苯乙烯濃度1~7 mg/L時(shí)均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)趨勢(shì)一致．與5~7 mg/L苯乙烯濃度相比，在1~4 mg/L時(shí)，MJ001的延遲期較短，到穩(wěn)定期生物量較大．可見MJ001在苯乙烯濃度1~7 mg/L時(shí)均能生長(zhǎng)良好，隨著苯乙烯濃度的增加菌體濃度增加，在4 mg/L時(shí)，菌體濃度最大，大于4 mg/L時(shí)，由于苯乙烯的毒性，菌體濃度開始下降，但是穩(wěn)定期時(shí)間較長(zhǎng)，這可能由于苯乙烯濃度大，能持續(xù)提供營(yíng)養(yǎng)．

圖5可以看出在不同的苯乙烯濃度下菌株MJ001對(duì)苯乙烯的降解情況略有不同．降解30h后，苯乙烯濃度在1~4 mg/L時(shí)，菌株MJ001對(duì)苯乙烯的降解率隨著苯乙烯濃度的增加而增加，苯乙烯濃度在4 mg/L時(shí)達(dá)到96.3%，但總體來看降解率在93.2%~96.3%之間，差別不大．而當(dāng)苯乙烯濃度增加到5 mg/L后，隨著苯乙烯濃度的增加，降解率開始下降，苯乙烯濃度7 mg/L時(shí)降解率降到82.7%，這與此時(shí)的菌體濃度低的結(jié)果是一致的，原因也是一致的．

2.6 溫度對(duì)菌株MJ001降解效果的影響

考查在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5個(gè)溫度下菌株MJ001對(duì)苯乙烯的降解情況，苯乙烯濃度4 mg/L．培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)苯乙烯降解情況，不同溫度下的降解效果見圖6．溫度在30℃時(shí)對(duì)苯乙烯的降解率最大，可達(dá)95.3%，溫度過高和過低都影響對(duì)苯乙烯的降解，這與30℃為該菌株的最適生長(zhǎng)溫度有關(guān)．

2.7 溶氧對(duì)菌株MJ001降解效果的影響

研究不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)苯乙烯降解效果的影響，選取8個(gè)不同的轉(zhuǎn)速，其它條件相同，考核溶解氧對(duì)MJ001的降解效果的影響，結(jié)果見圖7．由圖7可見不同的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株MJ001的降解效果幾乎沒有影響，這與菌株兼性厭氧的特性一致．

圖3 MJ001的代謝指紋特征圖Fig.3 The metabolic characteristics of MJ001

圖4 MJ001在不同苯乙烯濃度下的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of MJ001 under different styrene concentration

圖5 MJ001對(duì)不同濃度苯乙烯的降解率Fig.5 The degradation rate of styrene under different concentration

圖6 不同溫度下MJ001對(duì)苯乙烯的降解率Fig.6 The effect of degradation rate of styrene on temperature

2.8 菌株在廢水中的降解試驗(yàn)

選取了5個(gè)低濃度的苯乙烯廢水，研究菌株MJ001對(duì)真實(shí)廢水的降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在8h之內(nèi)能降解苯乙烯總量的77.6%~88.5%，16 h之后苯乙烯降解89.6%~90.1%，24 h后各種濃度的苯乙烯溶液幾乎均能得到充分降解，苯乙烯終濃度小于0.5 mg/L，降解效率達(dá)到94%~96.2%，見表1．

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)MJ001的降解效果的影響Fig.7 The effect of degradation rate to styrene on shaker speed

表1 廢水中的降解實(shí)驗(yàn)Tab.1 The degradation of styrene in waste water

3 討論

微生物降解苯乙烯的報(bào)道國(guó)內(nèi)外均有，本研究采用唯一碳源篩選的方法從處理含苯乙烯廢水的活性污泥中篩選得到一株苯乙烯降解菌，命名MJ001．采用分子生物學(xué)鑒定和Biolog快速鑒定兩種方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果為Pseudomonas aeruginosa．研究了菌株在不同苯乙烯濃度、溫度、溶氧條件下的降解效果，該菌株30℃時(shí)，在一定苯乙烯濃度下均能較好的降解苯乙烯，在實(shí)際含苯乙烯廢水中對(duì)苯乙烯的降解率可達(dá)94%以上，達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)．本文研究表明MJ001用于生物降解苯乙烯是可行的．

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