酶催化乳酸銨制備乳酸乙酯工藝條件的研究

王營營，姜艷軍，周麗亞，高 靜

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

0 前言

乳酸乙酯具有無毒、溶解性好、不易揮發(fā)及可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，可作為制藥工業(yè)中制壓片潤滑劑和某些藥品的中間體，還是常用的食品香料和生產(chǎn)酒類食品的重要原料，被廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和其他精細(xì)化工品領(lǐng)域，是極具開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的“綠色溶劑”[1-2]．

制備乳酸乙酯的原料主要以乳酸和乙醇為主[3-7]，而乳酸是由乳酸銨酸化得到，用乳酸銨代替乳酸與乙醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，不僅避免了乳酸對容器的腐蝕性，而且縮短了工藝流程，降低了乳酸乙酯的生產(chǎn)成本，為乳酸乙酯的合成開辟了新的途徑[8-12]．

目前，以乳酸銨為原料合成乳酸乙酯的催化劑主要是酸催化劑．酸催化劑具有污染環(huán)境、腐蝕設(shè)備等缺點(diǎn)．Walkup等[12]采用CO2促進(jìn)乳酸銨的分解，增加了乳酸乙酯的產(chǎn)率，但對反應(yīng)容器的要求較高，需要較高的壓力（1~200大氣壓），而且CO2與NH3的分離比較困難．

生物酶具有低能耗，反應(yīng)條件溫和，專一性強(qiáng)等特點(diǎn)．目前未見有關(guān)酶催化乳酸銨合成乳酸乙酯的報(bào)道．本文以脂肪酶為催化劑，以乳酸銨及乙醇為原料合成乳酸乙酯，為乳酸乙酯的合成提供了新的途徑．

1 材料與方法

1.1 材料

Novozym435(固定化于大孔丙烯酸樹脂的南極假絲酵母脂肪酶B)；CCL（非固定化南極柱狀酵母脂肪酶），LipozymeTLIM（固定化于硅膠的嗜熱真菌脂肪酶），以上脂肪酶均購于諾維信公司；乳酸銨，購于北化恒業(yè)精細(xì)化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純，購于天津市江天化工技術(shù)有限公司；水浴振蕩器WE-2（天津歐諾儀表儀器有限公司）；氣相色譜儀SP-1000（北京北分瑞麗分析儀器公司）．

1.2 方法

1.2.1 乳酸乙酯的合成

將乳酸銨和乙醇按照一定比例加入50mL的具塞錐形瓶中，再加入一定量的有機(jī)溶劑使反應(yīng)物總體積為10mL，充分混合后加入一定質(zhì)量的脂肪酶，在特定的溫度和搖床轉(zhuǎn)速下反應(yīng)一定時(shí)間．

1.2.2 水解酶活的測定

參照趙天濤[4]論文中水解酶活的測定方法，將每克酶每分鐘催化產(chǎn)生1脂肪酸定義為一個(gè)活力單位

1.2.3 酶的穩(wěn)定性

反應(yīng)結(jié)束后，過濾分離脂肪酶和反應(yīng)液，脂肪酶經(jīng)叔丁醇沖洗加入到新鮮反應(yīng)底物中進(jìn)行下一次的催化反應(yīng)，反應(yīng)條件不變．

1.2.4 乳酸乙酯的檢測

采用SP-1000型氣相色譜儀（PEG-20M，填充柱為2m× 3mm）測定乳酸乙酯，TCD檢測器，配浙江大學(xué)N2000雙通道色譜工作站，柱箱溫度為100℃、進(jìn)樣器170℃、檢測室160℃、熱絲180℃，環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)物．

2 結(jié)果與討論

2.1 酶和溶劑的選擇

考察了常用的3種脂肪酶和不同有機(jī)溶劑對催化反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1．由表1可看出，在所選擇的脂肪酶中，只有Novozym435具有催化活力，且在叔丁醇中的活性最高，其它兩種酶在不同溶劑中均不具有催化能力；可能的原因是：叔丁醇維持了一定的疏水環(huán)境，增加了固定化酶的穩(wěn)定性．同時(shí)，叔丁醇的加入降低了反應(yīng)體系粘度，增加了反應(yīng)傳質(zhì)速率[6,13]．故選擇Novozym435作為催化劑，以叔丁醇為反應(yīng)介質(zhì)．

表1 不同脂肪酶在不同溶劑中對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Tab.1 Effect of different lipases on the yield of ethyl lactate in different solvents

2.2 底物配比對催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示．由圖1可見，在反應(yīng)體系中，隨著乙醇添加量的增加，乳酸乙酯產(chǎn)率逐漸增大，銨醇物質(zhì)的量之比達(dá)到1∶24時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率達(dá)到最大．由于酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，隨著乙醇量的增加，平衡向正向移動，產(chǎn)率逐漸增加．但乙醇量太大，產(chǎn)率反而下降，這是由于過量加入乙醇導(dǎo)致酶失活，造成乳酸乙酯產(chǎn)率降低．因此，選擇銨醇物質(zhì)的量之比為1∶24．

2.3 反應(yīng)時(shí)間對催化反應(yīng)的影響

由圖2可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，乳酸乙酯產(chǎn)率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24h時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率最大，隨后變化平緩，反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為24h．

2.4 底物濃度對催化反應(yīng)的影響

由圖3可以看出：隨著乳酸銨濃度的增加，乳酸乙酯產(chǎn)率逐漸增大，當(dāng)乳酸銨濃度為0.2mol/L時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率達(dá)到28.58%，之后，隨著乳酸銨濃度的增大，乳酸乙酯產(chǎn)率明顯降低．可能的原因是：1）隨著乳酸銨濃度的增大，利于反應(yīng)正向進(jìn)行，乳酸乙酯產(chǎn)率升高；2）過量的乳酸銨奪取了酶分子表面的必需水，加速了酶的失活；3）乳酸銨濃度增大的同時(shí)，乙醇濃度也不斷增加，增大了乙醇對酶的失活作用，使乳酸乙酯產(chǎn)率下降．因此，選擇乳酸銨濃度為0.2 mol/L．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示．

2.5 溫度對催化反應(yīng)的影響

溫度對反應(yīng)的影響如圖4所示．由圖4可見，隨著反應(yīng)溫度的增加，產(chǎn)率逐漸升高，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率最大，為28.58%，原因可能是：隨溫度的提高，底物的粘度降低，擴(kuò)散阻力減小，利于酶與底物充分接觸；當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，酶受熱失活，使產(chǎn)率下降，因此，選擇反應(yīng)溫度為60℃．

2.6 酶濃對催化反應(yīng)的影響

酶濃定義為酶的質(zhì)量與底物乳酸銨的物質(zhì)的量之比（g/mol ammoniumlactate）．如圖5所示，隨著脂肪酶用量的增加，酶與底物接觸幾率增加，反應(yīng)速度相應(yīng)加快，當(dāng)酶量為40g/mol時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率達(dá)到32.38%，但進(jìn)一步增加酶用量，乳酸乙酯產(chǎn)率變化趨于平穩(wěn)，可能是由于反應(yīng)過程中酶量過多造成酶的團(tuán)聚，增大了傳質(zhì)阻力．因此，選擇反應(yīng)酶濃為40 g/mol．

2.7 搖床轉(zhuǎn)速對催化反應(yīng)的影響

由圖6可看出，隨著轉(zhuǎn)速的增加，產(chǎn)率逐步提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，乳酸乙酯產(chǎn)率達(dá)到32.38%，轉(zhuǎn)速進(jìn)一步提高，乳酸乙酯產(chǎn)率明顯下降，可能是提高轉(zhuǎn)速會增加固定化酶顆粒間的碰撞幾率，導(dǎo)致反應(yīng)過程中大量酶分子脫落，游離的脂肪酶在長時(shí)間的反應(yīng)中更易受到環(huán)境的影響而失活，因此，選擇催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為150 r/min．

2.8 酶的穩(wěn)定性

脂肪酶催化合成乳酸乙酯的主要問題是酶的制備成本比較高且易失活，實(shí)驗(yàn)考察了酶在叔丁醇體系中催化乳酸乙酯工藝的穩(wěn)定性．由圖7可以看出，脂肪酶重復(fù)使用5次，乳酸乙酯產(chǎn)率仍可達(dá)到22.1%．

圖1 乳酸銨/乙醇摩爾比對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of molar ratio of the substrates on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：乳酸銨濃度0.3 mol/L，酶濃33 g/mol，60℃，150 r/min，24 h

圖2 反應(yīng)時(shí)間對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，乳酸銨濃度0.3 mol/L，酶濃33 g/mol，60℃，150 r/min

圖3 乳酸銨濃度對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of the ammonium lactate concentration on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，酶濃33 g/mol，60℃，150 r/min，24 h

3 結(jié)論

本文研究了乳酸銨在固定化脂肪酶Novozym435催化下與乙醇合成乳酸乙酯的可行性，結(jié)果表明，以酶為催化劑，用乳酸銨為原料合成乳酸乙酯是可行的，通過對底物物質(zhì)的量之比、反應(yīng)時(shí)間、乳酸銨濃度、反應(yīng)溫度、酶濃和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，乳酸乙酯產(chǎn)率可達(dá)32.38%，固定化酶重復(fù)使用5次，乳酸乙酯產(chǎn)率仍保持在22%以上，雖然產(chǎn)率較低，但反應(yīng)具有工藝線路短，溫度較低，條件溫和，污染少，反應(yīng)安全等特點(diǎn)，符合環(huán)保要求，有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值．

圖4 反應(yīng)溫度對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，乳酸銨濃度0.2 mol/L，酶濃33 g/mol，150 r/min，24 h

圖5酶濃對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of enzyme concentration on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，乳酸銨濃度0.2 mol/L，60℃，150 r/min，24 h

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of agitation speed on the yield of ethyl lactate反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，乳酸銨濃度0.2 mol/L，酶濃40 g/mol,60℃，24 h

圖7 酶的穩(wěn)定性Fig.7 Operational stability of lipase反應(yīng)條件：銨醇摩爾比1∶24，乳酸銨濃度0.2 mol/L，酶濃40 g/mol，60℃，24 h

[1]黃志紅，高靜，周麗亞，等．乳酸乙酯合成研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢 [J]．化工進(jìn)展，2009，28（1）：150-154．

[2]Pereira CSM，Zabka M，Silva V M T M，et al．A novel process for the ethyl lactate synthesis in a simulated moving bed reactor(SMBR)[J]．Chem Eng Sci，2009，64（14）：3301-3310．

[3]Major B，Kelemen-Horváth I，Csanádi Z，et al．Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid and ethanol in phosphonium type ionic liquids as co-solvents[J]．Green Chem，2009，11（5）：614-616．

[4]趙天濤，高靜，張麗杰，等．有機(jī)相中脂肪酶催化合成乳酸乙酯 [J]．催化學(xué)報(bào)，2006，27（6）：537-540．

[5]Sun Xiao hong，Wang Qing hui，Zhao Wen chao，et al．Extraction and purification of lactic acid from fermentation broth by esterification and hydrolysis method[J]．Sep Purif Technol，2006，49（1）：43-48．

[6]Hasegawa S，Azuma M，Takahashi K．Enzymatic esterication of lactic acid，utilizing the basicity of particular polar organic solvents to suppress the acidity of lactic acid[J]．J Chem Technol Biot，2008，83（11）：1503-1510．

[7]Hasegawa S，Azuma M，Takahashi K．Stabilization of enzyme activity during the esterification of lactic acid in hydrophobic ethers and ketones as reaction mediathat aremisciblewith lactic acid despite their high hydrophobicity[J]．Enzyme Microb Tech，2008，43（3）：309-316．

[8]Wang Qing hui，Zhao Wen chao，Sun Xiao hong，et al．Preparation and characterization of a magnetic solid acid for esterification of ammonium lactate with n-butanol [J]．Catal Lett，2008，121（3-4）：324-330．

[9]張洪起，高靜，周麗亞，等．由乳酸銨直接合成乳酸乙酯的研究 [J]．化學(xué)研究與應(yīng)用，2006，18（3）：334-336．

[10]Costello EJ，F(xiàn)ilachione EM．Preparation and Properties of Pure Ammonium DL-Lactate[J]．JAm Chem Soc，2002，75（5）：1242-1244．

[11]Filachione EM，Costello EJ．Lactic estersby reaction of ammonium lactate with alcohols[J]．Ind Eng Chem，1952，44（9）：2189-2191．

[12]Walkup PC，Rohrmann CA，Hallen RT，et al．Production of esters of lactic acid,esters of acrylic acid,lactid acid,and acrylic acid[P]．US：5252473，1991-09-23．

[13]Divakar S，Manohar B．Use of Lipases in the Industrial Production of Esters[M]．Netherlands：Springer Netherlands，2007．283-300．