基于納米金復(fù)合探針的基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法

李海燕，景奉香，高秋月，賈春平，陳季武，金慶輝，趙建龍

1 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062

2 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所，上海 200050

生物技術(shù)與方法

基于納米金復(fù)合探針的基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法

李海燕1,2，景奉香2，高秋月1，賈春平2，陳季武1，金慶輝2，趙建龍2

1 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062

2 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所，上海 200050

建立了一種基于納米金復(fù)合探針的基因芯片膜轉(zhuǎn)印核酸檢測新方法。首先，用納米金顆粒同時標(biāo)記檢測探針P2和兩種長短不同且生物素化的信號探針 (T10,T40)，其中檢測探針與靶DNA 5′端互補，兩種信號探針起信號放大作用。當(dāng)靶DNA分子存在時，芯片表面捕捉探針P1 (與靶DNA分子3′端互補) 通過堿基互補配對原則結(jié)合靶DNA分子，將其固定于芯片上，同時檢測探針通過與靶DNA 5′端互補配對將納米金復(fù)合探針結(jié)合于芯片表面，結(jié)果在芯片表面形成“三明治”結(jié)構(gòu)，后通過鏈霉親和素-生物素反應(yīng)，使芯片表面對應(yīng)有靶 DNA分子的部位結(jié)合上堿性磷酸酶，最后利用BCIP/NBT顯色系統(tǒng)使芯片表面信號結(jié)果鏡面轉(zhuǎn)印至尼龍膜表面。當(dāng)檢測探針和信號探針摩爾比為1∶10，T10和T40摩爾比為9∶1時可以檢測1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L結(jié)核分枝桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測結(jié)果通過普通的光學(xué)掃描儀讀取或肉眼直接判讀信號有無。本芯片檢測系統(tǒng)靈敏度高，操作方法簡單、快速，不需要特殊儀器設(shè)備，在生物分子的檢測方面具有較高的應(yīng)用價值。

納米金復(fù)合探針，基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法，雜交，DNA檢測

Abstract:We report here a novel membrane transfer-based DNA detection method, in which alkaline phosphatase labeled gold nanoparticle (AuNP) probes were used as a means to amplify the detection signal. In this method, the capture probe P1,complimentary to the 3′ end of target DNA, was immobilized on the chip. The multi-component AuNP probes were prepared by co-coating AuNPs with the detecting probe P2, complimentary to the 5′ end of target DNA, and two biotin-labeled signal probes (T10 and T40) with different lengths. In the presence of target DNA, DNA hybridization led to the attachment of AuNPs on the chip surface where specific DNA sequences were located in a “sandwich” format. Alkaline phosphatase was then introduced to the surface via biotine-streptavidin interaction. By using BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit, a colorimetric DNA detection was achieved through membrane transfer. The signal on the membrane was then detected by the naked eye or an ordinary optical scanner. The method provided a detection of limit of 1 pmol/L for synthesized target DNA and 0.23 pmol/L for PCR products ofMycobacterium tuberculosis16S rDNA when the ratio of probes used was 9:1:1 (T10:T40:P2). The method described here has many desirable advantages including high sensitivity, simple operation, and no need of sophisticated equipment. The method can be potentially used for reliable biosensings.

Keywords:gold nanoparticle probes, memberane transfer-based DNA chip, hybridization, DNA detection

基因芯片技術(shù)是上世紀(jì) 90年代初發(fā)展起來的一種全新的生物微量分析技術(shù)。目前通用的基因芯片技術(shù)，生物樣品 DNA需經(jīng)PCR擴(kuò)增，且多采用熒光素或同位素為信號報告分子，均不同程度地存在著靈敏度不高、較高的儀器設(shè)備要求、操作復(fù)雜、易污染等缺陷，從而限制了該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用[1-2]。

納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一門新興科技。納米金顆粒 (Gold nanoparticles) 是指直徑為納米范圍的金顆粒制作簡單，且具有很好的生物兼容性，可以通過弱的相互作用與生物大分子結(jié)合，也可以通過化學(xué)鍵與生物大分子偶聯(lián)而不改變其生物活性，多年來一直在生物科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。隨著納米技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，由于納米金顆粒直徑小、比表面積大，因此單位面積可以連接數(shù)量很多的生物分子起到信號放大的作用，并且標(biāo)記了納米金顆粒的生物活性分子的結(jié)合性質(zhì)也得到了很大的提高[2-3]，這種利用納米金作為探針進(jìn)行生物分子的檢測與傳統(tǒng)檢測方法相比有諸多優(yōu)點[4-5]。Mirkin CA課題組報道的“生物條形碼擴(kuò)增技術(shù)”(Bio-bar-code amplification，BCA) 就是一例將納米金顆粒與多種生物分子結(jié)合應(yīng)用于生物學(xué)檢測的典范[6-7]，納米金不再僅僅作為信號分子，而作為一種信號分子的載體，為特定DNA序列檢測的研究和應(yīng)用開辟了一個嶄新領(lǐng)域。

近幾年，基于納米金的基因芯片檢測方法已成為一種趨勢[6,8-9]。Xi等[9-10]用納米金探針結(jié)合尼龍膜斑點雜交法，可檢測 10 pmol/L合成靶 DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用Fe @Au納米顆粒 (內(nèi)核為氧化鐵，外殼為金) 探針結(jié)合尼龍膜斑點雜交法，同樣可檢測10 pmol/L合成靶DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用磁分離的方法對核酸進(jìn)行富集可將檢測靈敏度提高到1 pmol/L，此法沒有對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。且該方法操作以及實驗結(jié)果影響因子較復(fù)雜。2009年，本實驗室開發(fā)出采用納米金結(jié)合熒光信號探針進(jìn)行基因芯片檢測的方法[11]，同樣可以達(dá)到1 pmol/L合成靶DNA的檢測限，此法也沒有對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，由于納米金顆粒本身是熒光的強(qiáng)烈淬滅劑，對實驗過程及操作要求較嚴(yán)格，探針價格也較昂貴，且需特殊的儀器設(shè)備進(jìn)行檢測，故實際應(yīng)用中熒光檢測法也將受到很大限制。

本文在熒光檢測法基礎(chǔ)上，開發(fā)新型的納米金復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，結(jié)合本實驗室開發(fā)的基因芯片的膜轉(zhuǎn)印檢測法，進(jìn)行一種新型基因芯片檢測方法的研究。即在納米金表面按照一定的比例，同時標(biāo)記與靶DNA互補的DNA檢測探針和標(biāo)記有生物素的信號探針構(gòu)成納米金復(fù)合探針，利用生物素-鏈霉親和素反應(yīng)，用 BCIP/NBT顯色系統(tǒng)顯色使對應(yīng)有靶DNA分子部位的尼龍膜顯色，然后直接裸眼或者采用常規(guī)的光學(xué)掃描儀掃描記錄、判斷實驗結(jié)果。并用此方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis特異性片段的快速檢測。結(jié)核病 (Tuberculosis) 在全球廣泛流行，嚴(yán)重危害人類健康，成為全球重大公共衛(wèi)生問題和社會問題[12-14]。目前結(jié)核病診斷及分枝桿菌分型主要依賴于顯微檢測、分離培養(yǎng)以及生化分析等方法，但由于前者靈敏度不高[15]，后者檢測時間長、操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用受到很大限制。因此探索快速、廉價、高靈敏度檢測結(jié)核分枝桿菌對結(jié)核病預(yù)防、發(fā)現(xiàn)、診治具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑

基因芯片、納米金溶液由本實驗室自行制備；HAuCl4·3H2O、檸檬酸三鈉、PVP、Tween-20、BSA、PEG8000、PEG20000購自 Sigma公司；膠體金重懸液 (0.1 mol/L Tris-HCl，PVP，Tween-20，BSA，PEG8000，蔗糖)；0.1 mol/L PB (pH 7.2)；0.1 mol/L PBS (pH 7.2)；5 mol/L NaCl；洗脫緩沖液I (0.2×SSC，0.1% SDS)；洗脫緩沖液II (0.05 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，0.3% Tween-20，pH 7.5)；親和素酶聯(lián)連體 (150 U，200 μL)、雜交液 EasyHyb、封閉劑、BCIP/NBT 顯色液購自 Roche Germany；封阻液 (0.05 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，1%封閉劑)；平衡液 (0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl2，0.1 mol/L Tris-HCl，pH 9.5)； 尼 龍 膜(Hybond)；TaqDNA聚合酶 (TaKaRa)；dNTPs (GE Healthcare Life Science)；QIAquick?PCR purification kit (QIAGEN)；銀染液 (現(xiàn)配現(xiàn)用)；NaNO3洗液。

如表1所示，所需探針序列均由TaKaRa公司合成。

1.1.2主要儀器

芯片點樣儀 (型號Prosys 5510A，Cartesian)，PCR 儀 (型號 TP600，TaKaRa)，AlphaImager TM2200 (Alpha Innotech)，雜交儀 (型號 FYY-3，興化市儀器分析廠)，Simplicity水純化系統(tǒng) (法國Millipore)，紫外-可見光光譜儀 (型號 V-670，Jasco)，高速冷凍離心機(jī) (型號5804R，Eppendorf)，精密數(shù)顯酸度計 (型號pHS-3TC，上海天達(dá)儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (型號DGG-9053A，上海森信實驗儀器有限公司)，超聲儀 (型號 SCQ150，上海聲浦超聲設(shè)備廠)。

表1 核酸探針序列表Table 1 DNA sequences

1.2 芯片制備

芯片點樣儀將氨基修飾探針 (圖1中 P1、P3、P4) 點陣于醛基化修飾芯片表面，點直徑100 μm，點間距500 μm，點樣量為0.7 nL，DNA探針濃度為75 μmol/L，用點樣儀分別取3種探針溶液點于芯片相應(yīng)位置 (圖1)。點陣好的芯片置濕度75%、溫度30℃密閉空間固定24～48 h。

1.3 靶DNA分子、探針及引物的設(shè)計

細(xì)菌16S rDNA由于其功能保守，進(jìn)化緩慢，因此我們根據(jù)結(jié)核分枝桿菌16S rDNA基因保守區(qū)核酸片段序列進(jìn)行合成靶DNA分子、探針及引物的設(shè)計 (GenBank Accession No. X52917)。

1.4 結(jié)核分枝桿菌16S rDNA基因保守區(qū)擴(kuò)增

PCR采用50 μL擴(kuò)增體系，共3管。結(jié)核分枝桿菌基因組DNA樣品2 μL與48 μL PCR擴(kuò)增體系混合 (擴(kuò)增體系包括: 10× PCR反應(yīng)緩沖液，25 mmol/L MgCl2，650 μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.5 μmol/L，2 UTaqDNA聚合酶) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，60℃退火 30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 納米金探針制備

1.5.1納米金顆粒的制備[16]

圖1 基因芯片點樣模式Fig.1 Spotting mode of gene chip.

配制1 nmol/L的HAuCl4溶液、38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液。按預(yù)先設(shè)計的反應(yīng)條件量取250 mL HAuCl4溶液加熱回流 10 min并攪拌，快速加入25 mL檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色由淺黃迅速變?yōu)樯罴t時，再持續(xù)加熱回流15 min并攪拌，待溶液自然冷卻至室溫 (持續(xù)攪拌)，用0.22 μm硝酸纖維薄膜過濾器過濾，即可得到尺寸為13 nm的納米金溶液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2納米金復(fù)合探針標(biāo)記

納米金顆粒表面標(biāo)記有3種巰基修飾的DNA探針：2種是帶有生物素的信號探針 (T10、T40)，起信號放大作用；第3種是能與靶DNA分子另一端互補的檢測探針 (P2)。

納米金復(fù)合探針的標(biāo)記方法：取1 mL濃度為12.5 nmol/L的13 nm納米金溶液于EP管中，9 000 r/min離心 50 min，棄上清，沉淀用 100 μL 0.1 mol/L PB (0.01% SDS，pH 7.2) 重懸；向重懸液中加入 100 μmol/L 的 DNA 探針 4 μL (P2、T10、T40按一定比例混合，使探針終濃度為4 μmol/L)，充分混勻，室溫放置20 min；用5 mol/L NaCl調(diào)NaCl濃度至0.1 mol/L，超聲處理10s后；放置25℃雜交儀中孵育過夜 (6 r/min)，然后加入 1/10體積 5%PEG (分子量為20 000)，4℃過夜。用膠體金重懸液洗滌4次，棄上清，加100 μL膠體金重懸液重懸，4℃儲存?zhèn)溆?。用紫?可見光光譜儀測其吸光光譜及OD值；用透射電鏡掃描DNA探針標(biāo)記前后的納米金。

1.6 芯片雜交及轉(zhuǎn)膜顯色

檢測過程：1 μL合成靶DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(預(yù)先變性) 與9 μL雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區(qū)，蓋上蓋玻片，置35℃預(yù)熱的雜交盒中雜交30 min，洗脫緩沖液Ⅰ洗滌芯片2 min，氮氣吹干。2 μL納米金復(fù)合探針溶液與8 μL雜交液混勻，均勻滴于晾干芯片的點陣區(qū)，35℃雜交30 min，洗脫緩沖液Ⅰ洗滌芯片5 min，氮氣吹干。向點陣區(qū)加Streptavidin-AP-conjugate (SA-AP) 稀釋液 (用封阻液稀釋 500倍) 15 μL，室溫反應(yīng)30 min，洗脫緩沖液II洗滌芯片5 min，然后用平衡液平衡1 min，氮氣吹干。用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片點樣區(qū)，蓋上蓋玻片，室溫避光放置30 min，純化水洗滌尼龍膜，肉眼根據(jù)信號有無判讀結(jié)果 (圖2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度計算

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光照射下可見一條長度約 200 bp的 dsDNA條帶 (圖 3)。將 3管 PCR產(chǎn)物混合，取 50 μL用QIAquick?PCR purification kit進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物用純化水定容至500 μL，用紫外-可見光光譜儀測其濃度為 2.85 ng/μL，根據(jù) QIAquick?PCR purification kit對PCR產(chǎn)物的回收效率為 95%，計算出原PCR產(chǎn)物濃度為30 ng/μL。根據(jù)PCR產(chǎn)物長度 (200 bp)、堿基對平均分子量 (649)，計算得出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的摩爾濃度約為0.23 μmol/L。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophorogram of PCR amplification products. M:DNA marker; 1?3: PCR amplification products; 4: negative control.

2.2 納米金復(fù)合探針標(biāo)記過程的優(yōu)化

2.2.1檢測探針和信號探針標(biāo)記比例優(yōu)化

納米金表面 DNA分子的密度和構(gòu)象對其雜交效率有重要影響，當(dāng)納米金表面DNA分子密度較高時，空間位阻會降低其雜交效率[17]；而當(dāng) DNA分子密度很低時，DNA分子中的堿基在納米金表面的非特異性吸附同樣會降低雜交效率[18]，因此，對納米金表面 DNA分子的組裝進(jìn)行研究至關(guān)重要。Mirkin等研究發(fā)現(xiàn)，在納米金表面標(biāo)記核酸時，與其他堿基相比，由于poly (T) 帶電性質(zhì)的不同，不容易在納米金表面堆積，因此可以得到更高的標(biāo)記效率[19]，并且在一個15 nm的納米金表面可以負(fù)載約160條左右的poly (T) 分子，本研究在此研究基礎(chǔ)上，探針濃度根據(jù)納米金濃度調(diào)整到納米金與總探針摩爾比為1∶320，然后進(jìn)一步優(yōu)化檢測探針和兩種不同長度信號探針 (T10、T40) 的標(biāo)記比例，結(jié)果表明，當(dāng)檢測探針與信號探針 (T10與T40摩爾比為1∶1) 摩爾比為1∶10時，檢測信號最強(qiáng) (圖4)。

圖 4 不同檢測探針與信號探針摩爾比 (T10∶T40=1∶1)在合成靶DNA濃度為100 nmol/L時芯片轉(zhuǎn)膜顯色圖Fig.4 Results of different ratios between detecting probe and signal probe (T10:T40=1:1) of 100 nmol/L synthesized target DNA. (a) 1:5. (b) 1:10. (c) 1:20. (d) 1:30.

2.2.2信號探針標(biāo)記比例優(yōu)化

在檢測探針與信號探針標(biāo)記比例確定的前提下(1∶10)，進(jìn)一步研究不同長度信號探針間比例(T10∶T40) 對雜交信號的影響。結(jié)果表明，當(dāng)T10與T40摩爾比為9∶1時，檢測信號最強(qiáng) (圖5)。

圖5 不同信號探針比例在合成靶DNA濃度為1 nmol/L時芯片轉(zhuǎn)膜顯色圖Fig.5 Results of different ratios between T10 and T40 of 1 nmol/L synthesized target DNA. (a) 2:8:1. (b) 5:5:1. (c) 7:3:1.(d) 9:1:1. (e) 19:1:2.

膜轉(zhuǎn)印檢測法的信號檢測原理是基于堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)。本研究通過信號探針的標(biāo)記將生物素分子結(jié)合到納米金表面，但是由于SA-AP的尺寸效應(yīng)大大限制了同一平面上生物素分子的利用率。本實驗采用長短不同的兩種信號探針同時對納米金進(jìn)行標(biāo)記 (圖2)，從三維上降低SA-AP與生物素反應(yīng)過程中由于SA-AP的尺寸效應(yīng)所帶來的空間位阻的影響，因此可以有效增加檢測信號強(qiáng)度。

2.3 納米金及納米復(fù)合探針的表征分析

由透射電鏡TEM (圖6A) 可知，制備的納米金顆粒粒徑為 (13±2) nm，大小均勻，分散良好，且周圍界面清晰。由圖6B可知，標(biāo)記后的納米金顆粒周圍有一層灰色的暈圈，表明DNA探針已標(biāo)記到納米金顆粒表面，且納米金顆粒仍可穩(wěn)定懸浮于溶液中，無聚集現(xiàn)象發(fā)生。

納米金顆粒隨粒徑的增大，對應(yīng)吸收峰的峰位會呈現(xiàn)向長波段紅移的趨勢[20]。采用紫外-可見光光譜對納米金顆粒溶液進(jìn)行 400～700 nm 波長范圍的掃描，表征樣品對應(yīng)的特征吸收峰。由圖6可見，未標(biāo)記DNA探針的納米金顆粒在521 nm左右有很強(qiáng)的吸收峰，已標(biāo)記 DNA探針的納米金顆粒在526.5 nm左右有很強(qiáng)的吸收峰，波段紅移說明納米金顆粒粒徑有所增大，DNA探針標(biāo)記到了納米金顆粒的表面。

圖6 標(biāo)記DNA探針前后的納米金TEM圖和紫外-可見光光譜掃描圖Fig.6 Scanning results of AuNPs and AuNP probes with TEM and UV-Vis Spectrophotometer. (A) TEM image of AuNPs. (B)TEM image of AuNP probes. (C) UV-Vis spectra of AuNPs and AuNP probes.

2.4 芯片雜交及膜轉(zhuǎn)印顯色結(jié)果與分析

本實驗采用納米金復(fù)合探針結(jié)合本實驗室開發(fā)的基因芯片膜轉(zhuǎn)印顯色法，在多個條件優(yōu)化下發(fā)現(xiàn)當(dāng)所用納米金顆粒上的檢測探針和信號探針的比例為1∶10，信號探針T10與T40的比例為9∶1時，可以檢測最低濃度為1 pmol/L的合成靶DNA分子(圖7) 或0.23 pmol/L的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖 8)，檢測信號好，肉眼可見，且隨 DNA 分子濃度降低，信號結(jié)果呈現(xiàn)減弱趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖7 納米金復(fù)合探針檢測不同濃度合成靶DNA芯片轉(zhuǎn)膜顯色圖Fig.7 Results of synthesized target DNA of different concentrations. (a) 10?10mol/L. (b) 10?11mol/L. (c) 10?12mol/L.(d) 10?13mol/L. (e) 0 mol/L.

圖8 納米金復(fù)合探針檢測不同濃度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物芯片轉(zhuǎn)膜顯色圖Fig.8 Results of PCR product of different concentrations. (a)2.3×10?11mol/L. (b) 2.3×10?12mol/L. (c) 2.3×10?13mol/L. (d)2.3×10?14mol/L. (e) 0 mol/L.

目前，基于納米金探針結(jié)合基因芯片銀染法對靶DNA的檢測已有諸多報道[21-23]。靶DNA一端與芯片上的捕獲探針雜交，另一端與納米金探針結(jié)合，在芯片上形成“三明治”結(jié)構(gòu)，通過銀染增強(qiáng)技術(shù)來判斷靶DNA的存在。用膜轉(zhuǎn)印顯色 (圖7) 后的基因芯片進(jìn)行銀染，用以比較膜轉(zhuǎn)印檢測法與銀染檢測法的靈敏度，如圖 9所示，納米金探針結(jié)合基因芯片銀染法也可肉眼判斷試驗結(jié)果，但其檢測靈敏度僅為100 pmol/L的合成靶DNA分子且陰性對照有干擾。由此可見，本文用納米金顆粒同時標(biāo)記一定比例檢測探針和兩種信號探針，采用膜轉(zhuǎn)印檢測法使檢測信號得到放大，靶DNA檢測具有更高的靈敏度 (可檢測1 pmol/L的合成靶DNA)。

圖9 銀染法檢測不同濃度合成靶DNA的芯片掃描圖Fig.9 Results of synthesized target DNA of different concentrations. (a) 10?8mol/L. (b) 10?9mol/L. (c) 10?10mol/L.(d) 10?11mol/L. (e) 0 mol/L.

納米金顆粒表面按照一定比例標(biāo)記檢測探針和兩種信號探針，檢測探針的作用是通過與芯片表面的靶DNA分子結(jié)合，將納米金 (帶有兩種生物素標(biāo)記的信號探針) 也結(jié)合于芯片表面；然后利用生物素-鏈霉親和素反應(yīng)，使芯片上與靶 DNA分子互補的探針結(jié)合上堿性磷酸酶；最后通過 BCIP/NBT顯色系統(tǒng)使芯片表面的結(jié)果鏡面轉(zhuǎn)印到尼龍膜上。由此可知，檢測探針與信號探針之間的比例是信號放大的關(guān)鍵。理論上，信號探針比例越高，信號放大倍數(shù)越大。然而實際上，信號探針比例越高，納米金上可以進(jìn)行有效雜交的檢測探針也越少，從雜交動力學(xué)上來講，也越不利于雜交反應(yīng)的右向發(fā)展[24]。因此本研究在二者比例為1∶10時得到最佳結(jié)果。

本研究信號分子實際上是SA-AP，實驗證明，由于SA-AP分子較大而形成的空間位阻效應(yīng)大大限制了SA-AP在納米金表面的結(jié)合效率。因此，本文使用長短不同的信號探針在納米金表面建立一個錯落有致的空間立體結(jié)構(gòu)，有效地解決了空間位阻問題。當(dāng)T10與T40摩爾比為9∶1時，檢測信號最強(qiáng)。

本研究中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的靈敏度 (0.23 pmol/L)稍高于合成靶DNA (ssDNA，1 pmol/L)，可能因為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列較長 (200 bp)，降低了納米金復(fù)合探針及SA-AP分子堆積時的空間位阻所致。一般情況下，長鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的空間位阻的確會大大減少其與芯片捕獲探針結(jié)合的幾率，但在本文實驗條件下，長為200 bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物形成的二級結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的空間位阻并沒有納米復(fù)合探針以及 SA-AP分子堆積時所產(chǎn)生的空間位阻大。主要是因為我們的PCR產(chǎn)物鏈不長，二級結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的空間位阻較納米復(fù)合探針以及SA-AP分子堆積時所產(chǎn)生的空間位阻小的緣故。

3 結(jié)論

本文提出的基于納米金復(fù)合探針的基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法，是根據(jù)納米金顆粒物化特性與生物學(xué)特性，將納米技術(shù)和基因芯片技術(shù)有機(jī)結(jié)合而建立起來的一種新的DNA分子檢測方法。實驗用納米金顆粒同時標(biāo)記檢測探針和長短不同的兩種信號探針，檢測探針是與待測靶DNA 5′端互補的DNA片段，生物素化信號探針起到信號放大和封閉作用。在靶DNA存在時形成捕捉探針P1-靶DNA-納米金復(fù)合探針組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，利用生物素-鏈霉親和素反應(yīng)，使芯片上對應(yīng)靶DNA分子部位結(jié)合上堿性磷酸酶，最后通過 BCIP/NBT顯色系統(tǒng)使芯片表面的結(jié)果鏡面轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，檢測結(jié)果可以通過普通的光學(xué)掃描儀讀取或者肉眼根據(jù)信號有無判讀。通過實驗，初步確定當(dāng)納米金上的檢測探針和信號探針比例為 1∶10，兩種信號探針 T10和 T40比例為 9∶1時結(jié)果最佳，其檢測下限為 1 pmol/L的合成靶DNA分子或0.23 pmol/L的結(jié)核分枝桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

綜上所述可見，納米復(fù)合探針的有效性不僅受納米金表面信號分子數(shù)量的影響，納米金表面探針的空間立體結(jié)構(gòu)對其有效性，包括雜交反應(yīng)以及信號標(biāo)記兩方面的的影響都非常大。本文在此方面只是進(jìn)行了初步的探索，如果在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對信號探針的分子組成、分子長度進(jìn)行進(jìn)一步的分析和優(yōu)化，有望得到更高的檢測靈敏度。

本文提出的基于納米金復(fù)合探針的基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法，檢測系統(tǒng)靈敏度高，不需要特殊設(shè)備，操作方法簡單、快速，尼龍膜上呈現(xiàn)的斑點清晰、穩(wěn)定、易長久保存，且無需特殊信號讀取設(shè)備，具有比較大的應(yīng)用潛力。

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1School of Life Science,East China Normal University,Shanghai200062,China
2Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200050,China

Received:March 1, 2010;Accepted:May 13, 2010

Supported by:Knowledge Innovation Program of Chinese Academy of Sciences (No. KGCX2-5YW-111-2).

Corresponding author:Fengxiang Jing. Tel/Fax: +86-21-62511070-8706; E-mail: jingfx@mail.sim.ac.cn

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